Génération de Gαi frappe | Groupe Shandong Forgings

Communications Biology volume 6, Article number: 112 (2023) Citer cet article

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Les récepteurs couplés aux protéines G (GPCR) sont des protéines essentielles de la membrane cellulaire qui détectent les molécules extracellulaires et activent les réponses cellulaires. La famille de la sous-unité α de la protéine G i (Gαi) représente le partenaire de couplage GPCR le plus courant et se compose de huit sous-unités avec des propriétés de signalisation distinctes. Cependant, l'analyse du modèle de couplage a été difficile en raison de l'expression endogène des sous-unités Gαi dans pratiquement toutes les lignées cellulaires. Ici, nous générons une lignée cellulaire HEK293 dépourvue de toutes les sous-unités Gαi, ce qui permet la mesure du couplage GPCR-Gαi lors de la réexpression transitoire d'une sous-unité Gαi spécifique. Nous profilons la sélectivité du couplage Gαi sur 11 GPCR en mesurant l'activité inhibitrice induite par le ligand pour l'accumulation d'AMPc. Les profils de couplage sont ensuite classés en trois clusters, représentant ceux préférentiellement couplés à Gαz, ceux à Gαo, et ceux à sélectivité inapparente. Ces résultats indiquent que les GPCR individuels couplés à Gαi affinent la signalisation Gαi en exerçant une préférence de couplage au niveau de la sous-unité Gαi.

Les récepteurs couplés aux protéines G (GPCR), les principaux transducteurs qui relient les stimuli extracellulaires aux signaux intracellulaires en aval, sont les cibles les plus courantes pour le développement de médicaments1. Lors de la liaison du ligand GPCR, les protéines hétéromères de liaison aux nucléotides de guanine (protéines G), constituées de sous-unités α, β et γ, induisent l'activation de leurs protéines effectrices. Parmi les trois sous-unités, la sous-unité α détermine principalement les propriétés clés des protéines G hétérotrimériques individuelles. Le génome humain code pour 16 sous-unités α, qui sont regroupées en quatre sous-familles en fonction de leur homologie de séquence et de leur similarité fonctionnelle, à savoir Gαs, Gαi, Gαq et Gα122. La sous-famille Gαi est le partenaire de couplage le plus courant dans la famille A GPCRs3,4. En outre, environ 45 % des GPCR ciblés par les médicaments approuvés par la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis se couplent à la sous-famille Gαi5, soulignant l'importance des GPCR couplés à Gαi en tant que cibles médicamenteuses.

Des études antérieures ont montré que les sous-unités Gαi ont des fonctions à la fois superposées et distinctes. La sous-famille Gαi se compose de huit sous-unités α : Gαi1, Gαi2, Gαi3, Gαt1, Gαt2, Gαt3, Gαo et Gαz. L'activation de l'hétérotrimère Gi induit divers processus de signalisation cellulaire tels que l'inhibition de l'adénylyl cyclase et des canaux calciques, et l'activation des canaux potassiques6. Malgré la forte homologie de séquence au sein de la sous-famille Gαi, plusieurs fonctions spécifiques aux sous-unités ont été rapportées. Par exemple, la transducine (Gαt1 et Gαt2) et la gustducine (Gαt3) sont impliquées respectivement dans la perception visuelle et gustative, toutes deux en activant la cGMP phosphodiesterase7,8. De plus, en utilisant des expériences d'inactivation de la sous-unité Gαi dans des cellules GH4C1, Gαo et Gαi2 se sont avérés médier l'inhibition de l'entrée du calcium et de l'accumulation d'AMPc, respectivement9. Les sous-unités Gαi se comportent également biochimiquement différentes les unes des autres. Il convient toutefois de noter que ces propriétés biochimiques pourraient être modifiées dans les cellules vivantes comme observé dans Gq, qui montre une dissociation des nucléotides plus lente en condition purifiée qu'en condition de membrane lipidique. Par exemple, le taux de dissociation spontanée du PIB de Gαo est d'un ordre de grandeur plus rapide que celui de Gαi1-310, et l'activité GTPase intrinsèque de Gαz est 200 fois plus lente que celle des autres sous-unités Gαi11. Ces différences entre les membres de la famille Gαi permettent diverses transductions de signaux GPCR couplés à Gαi.

Bien que les propriétés de signalisation des sous-unités Gαi aient été bien caractérisées, la sélectivité de couplage des sous-unités Gαi des GPCR n'a été étudiée que pour un nombre limité de récepteurs en raison de difficultés expérimentales. Le couplage GPCR-Gαi individuel ne peut pas être évalué simplement en exprimant une sous-unité Gαi d'intérêt car pratiquement toutes les cellules de mammifères expriment de manière endogène plusieurs sous-unités Gαi12. Pour éliminer le couplage GPCR-Gαi endogène, des études antérieures ont utilisé la toxine coquelucheuse (PTX), qui ADP-ribosyle le résidu cystéine dans la queue C-terminale des sous-unités Gαi13. En exprimant un mutant Gαi résistant à la PTX avec une substitution au niveau du résidu cystéine, le traitement à la PTX permet de mesurer le couplage sélectif de la sous-unité mutante Gαi14,15,16. Cependant, la modification du résidu cystéine peut affecter les capacités de couplage de la protéine G des sous-unités α17,18. De plus, la PTX n'inhibe pas Gαz car elle contient de l'isoleucine au site de ciblage de la PTX19. Récemment, des techniques basées sur le transfert d'énergie de résonance de fluorescence ou de bioluminescence ont été utilisées pour évaluer le couplage de sous-unités Ga individuelles conçues20,21. Cependant, ces méthodes nécessitent l'insertion de luciférase ou d'une protéine fluorescente dans la sous-unité α, et une telle modification affecte ses propriétés biochimiques et l'efficacité de couplage qui en résulte22.

Dans cette étude, nous avons contourné les difficultés expérimentales de mesure des sous-unités Gαi intactes individuelles en utilisant des approches d'édition du génome pour établir un fond Gαi-null dans les cellules 293A du rein embryonnaire humain (HEK). En exprimant de manière transitoire une paire d'un GPCR et d'une sous-unité Gαi d'intérêt dans les cellules HEK293A déficientes en Gαi, nous avons caractérisé avec succès les profils de couplage Gαi dans 11 GPCR et trouvé une sélectivité physiologiquement raisonnable des sous-unités Gαi pour ces GPCR.

Afin d'établir un arrière-plan Gαi-null pour l'analyse fonctionnelle des schémas de couplage des sous-unités Gαi, nous avons généré une lignée cellulaire HEK293A dépourvue de toutes les sous-unités Gαi. Tout d'abord, nous avons mesuré l'expression des sous-unités Gαi dans les cellules HEK293A par analyse quantitative RT-PCR. Alors que sept gènes codant pour la sous-unité Gαi (GNAI1, GNAI2, GNAI3, GNAO1, GNAT1, GNAT2 et GNAZ) étaient exprimés, l'expression de GNAT3 était indétectable (Fig. 1a). Pour valider la paire d'amorces PCR pour GNAT3, nous avons mesuré et confirmé l'expression de GNAT3 dans un échantillon de tissu de l'intestin grêle, dans lequel GNAT3 est connu pour être exprimé23 (Fig. 1 supplémentaire). Nous avons ensuite ciblé les sept gènes codant pour la sous-unité Gαi présents dans les cellules HEK293A en utilisant la mutagenèse CRISPR – Cas9 à trois cycles (Fig. 1b). Nous avons conçu des ARN à guide unique (ARNsg) pour induire un clivage de l'ADN double brin dans la moitié N-terminale de chaque sous-unité α. Lors de l'introduction réussie de mutations par décalage de cadre ou non-sens par ces ARNsg, les gènes mutés devraient produire des sous-unités Gαi tronquées avec l'élimination de l'hélice α5 c-terminale, qui est responsable du couplage des récepteurs24. Après la transfection des constructions d'ARNsg, l'isolement par tri cellulaire activé par fluorescence des cellules GFP-positives et l'expansion des colonies de cellules clonales, les clones ont été criblés pour détecter des mutations dans les gènes cibles à l'aide de la méthode des enzymes de restriction, obtenant un candidat clone knock-out (cellules ΔGαi) (Fig. 1c). Le séquençage Sanger des régions génomiques cibles a confirmé que les cellules ΔGαi portent des mutations de décalage de cadre ou de grandes insertions, y compris des codons d'arrêt, dans tous les allèles ciblés (Fig. 2 supplémentaire). L'expression de GNAT3 est restée non détectée dans les cellules ΔGαi (Fig. 1 supplémentaire). Ces résultats indiquent que les sept gènes codant pour la sous-unité Gαi ont été mutés avec succès dans les cellules HEK293A pour empêcher leur expression endogène.

a Analyse PCR quantitative en temps réel des sous-unités Gαi dans les cellules parentales HEK293A. Les barres et les barres d'erreur représentent la moyenne et l'erreur standard de la moyenne (SEM), respectivement, de trois expériences indépendantes. Chaque expérience a été réalisée en double. Abréviation : ND, non détecté. b Stratégie d'inactivation génétique des membres de la famille Gαi. Les cellules ∆Gαi ont été obtenues par mutagenèse CRISPR-Cas9 à trois cycles. c Identification du génotype du clone Gαi-mutant à l'aide de la méthode des fragments digérés par une enzyme de restriction. Les cibles sgRNA ont été amplifiées par PCR et traitées avec leurs enzymes de restriction correspondantes (RE). Les échantillons digérés ont été soumis à une analyse électrographique capillaire et des images de pseudo-gel de l'électrophérogramme ont été visualisées avec un marqueur d'ADN du produit de digestion pUC19/Hpa II. Les pointes de flèches noires et rouges indiquent respectivement les fragments de PCR non digérés et digérés par RE du site ciblé. Notez qu'il existe deux sites RE dans les fragments PCR des gènes GNAI2 et GNAT1, et l'un des allèles mutés dans le gène GNAI1 pourrait être digéré par RE. Abréviations : P parental, KO knock-out.

Ensuite, nous avons examiné fonctionnellement le manque de sous-unités Gαi dans les cellules ΔGαi à l'aide d'un test GloSensor cAMP. Nous avons exprimé le récepteur µ-opioïde (MOR), un récepteur prototypique couplé à Gαi, avec le rapporteur GloSensor cAMP et mesuré les niveaux d'AMPc lors de la stimulation avec le ligand, la méthionine-enképhaline (MetEnk), ainsi que la forskoline. Dans les cellules mères, l'accumulation d'AMPc stimulée par la forskoline était presque complètement inhibée d'une manière dépendante de la concentration de MetEnk (Fig. 2a). En revanche, les cellules ∆Gαi ne répondaient absolument pas à MetEnk, tandis que l'expression exogène de Gαi2 rétablissait leur réponse au ligand (Fig. 2b). Ces résultats montrent que les cellules ΔGαi sont dépourvues de sous-unités Gαi fonctionnelles, ce qui les rend adaptées à l'étude de la signalisation des sous-unités Gαi.

a, b Courbes concentration-réponse du test GloSensor cAMP dans les cellules mères (a) et ∆Gαi (b). Les cellules mères et ∆Gαi exprimant de manière transitoire le rapporteur d'AMPc Glo-22F avec MOR et Gαi2 ont été stimulées avec de la forskoline 10 µM avec les concentrations indiquées de MetEnk. Pour chaque expérience, l'accumulation d'AMPc induite par la forskoline a été fixée à 100 %. Dans les deux figures, les symboles et les barres d'erreur représentent la moyenne et le SEM, respectivement, de trois expériences indépendantes. Chaque expérience a été réalisée en triple. Notez que pour de nombreux points de données, les barres d'erreur sont plus petites que la taille des symboles et ne sont donc pas visibles.

Pour mieux caractériser les cellules ∆Gαi, nous avons comparé la prolifération cellulaire des cellules mères et ∆Gαi. Nous avons évalué la prolifération cellulaire en collectant les cellules 48 h après l'ensemencement et en comptant le nombre de cellules. La prolifération cellulaire des cellules ∆Gαi en 48 h a été réduite de 20% par rapport à celle des cellules mères (Fig. 3 supplémentaire). Semblables aux cellules ∆Gαi, les cellules mères traitées au PTX ont également montré une réduction de 20 % de la prolifération cellulaire par rapport à celle des cellules mères non traitées. Ce résultat suggère que la suppression de la prolifération cellulaire dans les cellules ∆Gαi n'est pas due à un effet clonal mais à la déficience sur cible des protéines Gαi. De plus, la prolifération réduite dans les cellules ∆Gαi et les cellules mères traitées au PTX ont toutes deux été récupérées en cultivant les cellules dans des boîtes recouvertes de collagène de type I (Fig. 3 supplémentaire), ce qui suggère que la suppression de la prolifération cellulaire est due à l'affaiblissement de l'adhérence des cellules ∆Gαi.

Pour examiner si l'autre signalisation de la protéine G serait affectée dans les cellules ΔGαi, les signalisations Gs, Gq et G12 ont été évaluées individuellement. Nous avons exprimé le récepteur V2 de la vasopressine couplé au Gs (V2R) ou le récepteur de la dopamine D1 (D1R) avec le rapporteur GloSensor cAMP dans les cellules ΔGαi et les cellules mères. Les cellules ont ensuite été stimulées avec leurs agonistes ou la forskoline, et mesurées pour leur accumulation d'AMPc. La signalisation Gs dans les cellules ΔGαi était améliorée par rapport à celle des cellules mères (Fig. 3a, b). Nous avons ensuite mesuré la signalisation Gq et G12 via un test de perte α du facteur de croissance transformant (TGF)25 en utilisant des GPCR couplés Gq- (H1R et α1A) ou G12- (EP3 et CB1). En utilisant des cellules déficientes en protéine G, nous avons précédemment validé que les réponses d'excrétion de TGFα induites par le Gq-GPCR testé (H1R et α1A) et le G12-GPCR testé (CB1 et EP3) dépendaient uniquement de Gq/11 et G12/13, respectivement3. Chaque GPCR a été exprimé avec un rapporteur TGFα marqué à la phosphatase alcaline (AP-TGFα) dans les cellules ∆Gαi et les cellules mères, puis mesuré pour leur réponse de rejet d'ectodomaine AP-TGFα induite par le ligand. La signalisation Gq et G12 dans les cellules ΔGαi était comparable à celle des cellules mères (Fig. 3c – f). Ces données démontrent que l'élimination des sous-unités Gαi n'affecte pas la signalisation Gq et G12 mais potentialise la signalisation Gs, probablement en raison de la perte de compétition dans les adenylyl cyclases entre Gs et Gi.

a, b Courbes concentration-réponse de l'accumulation d'AMPc médiée par le Gs. Les cellules mères et ∆Gαi exprimant de manière transitoire Glo-22F avec D1R ( a ) ou V2R ( b ) ont été stimulées avec les concentrations indiquées de dopamine ou d'arginine vasopressine (AVP), respectivement. c – f Courbe concentration-réponse des réponses d'excrétion de TGFα induites par l'activation des récepteurs couplés Gq- (H1R (c) et α1A (d)) et G12 (CB1 (e) et EP3 (f)) dans les cellules mères et ∆Gαi. Un GPCR test a été exprimé dans les cellules mères et ∆Gαi avec le rapporteur AP-TGFα, et la réponse résultante induite par le ligand a été évaluée. Dans toutes les figures, les symboles et les barres d'erreur représentent la moyenne et le SEM, respectivement, de trois expériences indépendantes. Chaque expérience a été réalisée en triple. Notez que pour de nombreux points de données, les barres d'erreur sont plus petites que la taille des symboles et ne sont donc pas visibles.

Nous avons également examiné si les GPCR couplés à Gi avaient accès à d'autres protéines Gα en l'absence de protéines Gαi en utilisant MOR comme exemple. Comme le montre la figure 2b, l'activation de MOR n'a pas augmenté l'AMPc dans les cellules ∆Gαi, ce qui montre qu'il ne se couple pas à Gs même en l'absence de Gαi. Nous avons en outre examiné si MOR se couple à Gq et G12 dans l'état déficient en Gαi en utilisant le test de perte de TGFα. Nous avons constaté que MOR ne présentait aucune réponse détectable de rejet de TGFα dans les cellules mères et les cellules ∆Gαi (Fig. 4 supplémentaire), ce qui indique que MOR ne parvient pas à se coupler avec Gq et G12 même en l'absence de protéines Gαi. Il convient de noter que nous avons validé l'activation de MOR dans le test de perte de TGFα en utilisant la protéine Gα chimérique Gαq / i1, qui se lie aux GPCR couplés à Gi et transduit la signalisation Gq, en tant que contrôle positif (Fig. 4 supplémentaire). Bien que ces données confirment que MOR ne se couple pas à Gα non préféré même en l'absence de Gα préféré, nous ne pouvons pas exclure la possibilité que d'autres GPCR couplés au Gi se comportent différemment. Ainsi, il est recommandé de considérer cette possibilité lors de l'analyse du couplage de la protéine G à l'aide des cellules déficientes en Gα.

Nous avons évalué les profils de couplage GPCR-Gαi en exprimant une paire de sous-unités GPCR et Gαi d'intérêt dans les cellules ∆Gαi. Nous avons choisi cinq sous-unités Gαi, à savoir Gαi1, Gαi2, Gαi3, Gαo et Gαz, sur les huit sous-unités Gαi pour la caractérisation suivante puisque les protéines effectrices physiologiques pour le reste des sous-unités Gαi (Gαt1, Gαt2 et Gαt3) sont connues pour être cGMP phosphodiesterase.

Pour déterminer les quantités appropriées de plasmides dans le test, nous avons testé plusieurs quantités de plasmides codant pour les sous-unités GPCR ou Gαi et comparé les courbes concentration-réponse. Tout d'abord, nous avons mesuré les niveaux d'expression membranaire de MOR, un GPCR représentatif utilisé dans l'étude, en titrant le plasmide codant pour MOR (100 ng de plasmide Gαi1 pour toutes les conditions MOR). À partir d'une dose de plasmide de 8 à 200 ng (par puits dans une plaque à 6 puits), les niveaux d'expression ont augmenté et son niveau n'a pas augmenté davantage dans la condition de 1 000 ng (Fig. 5a, b supplémentaires). Nous avons ensuite mesuré la réponse de l'AMPc médiée par Gi par le test GloSensor. La courbe concentration-réponse s'est déplacée vers la gauche lorsque la quantité de plasmide a augmenté et a atteint un plateau à un volume de 200 ng (Fig. 5c supplémentaire). Par conséquent, nous avons utilisé 200 ng du plasmide codant pour les GPCR de test dans les expériences ultérieures. Dans le cas de Gα, nous avons fixé le plasmide codant pour MOR à 200 ng et titré les quantités de plasmide de toutes les cinq sous-unités Gαi de 1 à 1 000 ng par 10 fois. Une dose de plasmide de 1 ng a montré un effet suppresseur d'AMPc négligeable, tandis qu'une dose de plasmide de 10 ng a partiellement inhibé la production d'AMPc (Fig. 5d supplémentaire). Des doses de plasmide de 100 et 1000 ng ont presque complètement inhibé la production d'AMPc. Nous notons que, à partir des volumes de plasmide de 10 à 1000 ng, la courbe concentration-réponse avait tendance à se déplacer vers la droite lorsque la dose de plasmide augmentait. Ensemble, des expériences ultérieures ont été réalisées avec une dose de plasmide codant pour Gαi de 100 ng.

Parce que le test GloSensor cAMP détecte principalement l'activation de Gαs sur Gαi, nous avons sélectionné 11 GPCR qui sont couplés à Gαi mais pas à Gαs, qui comprennent le récepteur de la dopamine D2 (D2R), le récepteur de la dopamine D4 (D4R), le récepteur opioïde de type mu (MOR), le récepteur de la somatostatine de type 2 (SSTR2), le récepteur cannabinoïde 1 (CB1), le récepteur de l'acide lysophosphatidique 1 (LPA1), le récepteur 1 de la sphingosine 1-phosphate (S1P1), le récepteur 3 de la sphingosine 1-phosphate (S1P3), le récepteur 34 probable couplé à la protéine G (GPR34), le récepteur de chimiokine C-C de type 2 (CCR2) et le récepteur de chimiokine CC de type 5 (CCR5). Des ligands endogènes comprenant la dopamine, la sérotonine, la méthionine-encéphaline, la somatostatine, l'acide lysophosphatidique, la sphingosine 1-phosphate, la lysophosphatidylsérine, CCL2 et CCL4 ont été utilisés pour tous les GPCR respectifs à l'exception de CB1, pour lequel un ligand synthétique de haute affinité (CP-55490) a été utilisé car les ligands endogènes tels que l'anandamide présentaient une faible réponses dans le test. Pour chaque GPCR, nous avons tracé les réponses d'AMPc à partir des cinq conditions Gαi et d'une condition Gαi non transfectée (Fig. 4a, Fig. 6 supplémentaire). L'inhibition de l'accumulation d'AMPc sur les concentrations de ligand titrées a été représentée graphiquement et équipée d'une courbe concentration-réponse sigmoïdale, à partir de laquelle les valeurs de concentration demi-maximale (EC50) et de réponse maximale (Emax) ont été obtenues (tableau supplémentaire 1). Nous avons trouvé des modèles divergents de couplage de la sous-unité Gαi parmi les 11 GPCR. Dans D2R, par exemple, toutes les sous-unités Gαi testées ont donné des concentrations saturantes équivalentes (correspondant aux valeurs Emax), mais la courbe concentration-réponse dans la condition exprimant Gαo s'est déplacée vers la gauche, ce qui reflète la différence des valeurs EC50. La préférence Gαo observée de D2R est cohérente avec les études précédentes utilisant des cellules Sf9 et des sous-unités Gαi intactes qui ont montré que D2R se couple le plus efficacement à Gαo26,27. Dans LPA1, en revanche, les réponses suppressives d'AMPc à des concentrations saturantes étaient comparables entre Gαi1–3 et Gαo, tandis que la réponse était plus faible dans Gαz.

a Courbes concentration-réponse des tests GloSensor cAMP dans les cellules ∆Gαi exprimant de manière transitoire Glo-22F avec certaines combinaisons de GPCR et de sous-unités Gαi. Les cellules ont été stimulées avec 10 µM de forskoline avec les concentrations indiquées de ligands. Pour chaque expérience, l'accumulation d'AMPc induite par la forskoline a été fixée à 100 %. Dans toutes les figures, les symboles et les barres d'erreur représentent la moyenne et le SEM, respectivement, de trois expériences indépendantes. Chaque expérience a été réalisée en triple. Notez que pour certains points de données, les barres d'erreur sont plus petites que la taille des symboles. b Schéma de principe montrant le processus de calcul des valeurs RAi. c Heatmap des valeurs LogRAi pour les 11 GPCR. Les couleurs vont du blanc (LogRAi = −1,5) au rouge (LogRAi = 0). Les récepteurs sont disposés selon le dendrogramme du regroupement hiérarchique, qui a été calculé à partir des profils de couplage.

Pour comparer la sélectivité de couplage de la sous-unité Gαi entre les récepteurs de manière uniforme, nous avons calculé un paramètre connu sous le nom d'activité intrinsèque relative (RAi)28. La valeur RAi est un paramètre unique qui prend en compte EC50 et Emax. Alors que RAi est couramment utilisé pour évaluer le biais du ligand, nous l'avons utilisé pour évaluer la préférence du récepteur pour les sous-unités Gαi. Pour chaque courbe sigmoïdale, nous avons divisé Emax par EC50 et normalisé les valeurs Emax/EC50 résultantes par la valeur Emax/EC50 maximale parmi les cinq sous-unités Gαi testées pour générer des valeurs Emax/EC50 relatives sans dimension (définies comme RAi, Fig. 4b). Nous avons ensuite transformé en log la valeur RAi (LogRAi) et l'avons utilisée comme indice de couplage de la sous-unité Gαi. Nous avons appliqué une analyse de cluster hiérarchique pour classer les GPCR et avons montré leur indice de couplage de sous-unité Gαi sous forme de carte thermique avec un arbre de clustering (Fig. 4c). Nous avons observé trois groupes dans l'analyse de clustering. Groupe 1 (S1P1, CCR2, S1P3, D4R et MOR) couplé efficacement à Gαz, suivi de Gαi1–3 et Gαo. Cluster 2 (D2R) couplé à Gαo, suivi de Gαi1–3, puis Gαz. Le groupe 3 (CB1, CCR5, GPR34, SSTR2 et LPA1) n'a pas montré de sélectivité pour des sous-unités Gαi spécifiques. Nous avons comparé le clustering basé sur le couplage Gαi avec les arbres phylogénétiques GPCR. Sur la base de la similarité des acides aminés et du regroupement des ligands de GPCRdb (https://gpcrdb.org), les récepteurs testés ont été classés en récepteurs lipidiques (LPA1, S1P1, S1P3, CB1), récepteurs orphelins (GPR34), récepteurs aminergiques (D2R, D4R), récepteurs de chimiokines (CCR2 et CCR5) et récepteurs peptidiques (MOR, SSTR2). Fait intéressant, cette classification est distincte du clustering basé sur le couplage. Ces résultats suggèrent que, d'un point de vue évolutif, chaque GPCR a acquis individuellement une sélectivité de sous-unité Gαi variable29.

Dans cette étude, nous avons établi une lignée cellulaire HEK293A déficiente en Gαi, les cellules ∆Gαi, afin d'étudier plus efficacement la préférence de couplage des sous-unités Gαi des GPCR. Les chercheurs ont déjà utilisé la PTX pour inhiber les protéines de la famille Gαi exprimées de manière endogène. Cependant, des mutants insensibles au PTX sont nécessaires pour évaluer la signalisation individuelle de la sous-unité Gαi dans les conditions traitées au PTX. De plus, la PTX est incapable d'inhiber Gαz. Une toxine AB5 de type toxine Escherichia coli pertussis appelée OZITX s'est récemment avérée inhiber toutes les protéines de la sous-famille Gαi, y compris Gαz30,31. Même avec cette toxine, une mutation Gαi C-terminale, qui peut affecter les propriétés de couplage, est nécessaire pour rendre les protéines de la sous-famille Gαi insensibles à l'OZITX. Les cellules ∆Gαi surmontent ces problèmes expérimentaux et permettent d'étudier non seulement le couplage des sous-unités GPCR-Gαi, mais également la signalisation en aval des sous-unités Gαi individuelles intactes.

La préférence de couplage de D2R pour Gαo ainsi que de D4R pour Gαz fournit des propriétés de signalisation adaptées aux fonctions physiologiques. Gαz a un taux de dissociation du GDP spontané lent ainsi qu'une faible activité GTPase intrinsèque11. Le D4R est exprimé dans la rétine et régule la nature circadienne de la vision adaptée à la lumière32,33. D4R et Gαz sont tous deux exprimés dans les cellules photoréceptrices et affichent un schéma d'expression quotidien qui culmine la nuit34. Un couplage efficace de D4R et Gαz peut permettre une régulation de la nature circadienne de la vision en tirant parti des propriétés d'activation à long terme de Gαz. Bien que D2R soit phylogénétiquement le plus similaire à D4R et comprend ensemble des récepteurs de type D2, D2R est efficacement couplé à Gαo. Contrairement à Gαz, Gαo a un taux de dissociation spontanée du PIB plus rapide que les autres sous-unités Gαi10. Par conséquent, il est probable que D2R possède des propriétés de signalisation à réponse rapide via Gαo, ce qui peut permettre une transduction rapide du signal entre les neurones. Au total, D2R et D4R utilisent probablement la sélectivité de couplage différentiel pour permettre une durée appropriée des résultats de signalisation dopaminergique. Étant donné que les propriétés de signalisation des GPCR dépendent également des profils d'expression Gα des cellules et de leur localisation, qui sont différents selon les types de cellules, les propriétés de signalisation de D2R et D4R in vivo doivent être étudiées plus avant dans les études futures.

Le MOR est une cible médicamenteuse importante pour les analgésiques. Dans une étude précédente utilisant des sous-unités PTX et Gαi insensibles au PTX, MOR était couplé plus efficacement à Gαi3 et Gαo qu'à Gαi1 et Gαi214. Cependant, dans nos conditions expérimentales, MOR se couple presque de manière comparable à Gαi1-3 et Gαo. Bien que la différence de quantité de protéines Gα entre les deux études puisse également affecter le couplage, cette différence observée peut être due à l'utilisation de la mutation C-terminale dans les sous-unités Gαi dans l'étude précédente afin de conférer une résistance à la PTX, suggérant l'importance d'évaluer la sélectivité des sous-unités Gαi en utilisant des sous-unités Gαi intactes. De plus, nous avons mesuré le couplage de MOR pour Gαz en parallèle avec Gαi1-3 et Gαo sans modifications dans les sous-unités α. Des expériences in vivo ont révélé des rôles différents des membres de la famille Gαi dans les effets analgésiques induits par la morphine : Gαz en administration chronique35,36 et Gαi2 et Gαo en action analgésique aiguë37,38. Compte tenu des ligands biaisés, qui induisent une activation effectrice distincte sur le même récepteur39,40,41, un agoniste MOR biaisé par Gαz pourrait potentiellement conduire au développement d'une analgésie à action prolongée avec une tolérance éventuellement plus faible. Dans l'ensemble, l'évaluation de la sélectivité de la sous-unité Gαi des agonistes MOR peut finalement améliorer notre compréhension des différences d'activité des médicaments et contribuer à la découverte d'analgésiques plus souhaitables.

En plus de nos cellules ∆Gαs, ∆Gαq et ∆Gα12 précédemment générées42,43,44, nous avons maintenant un ensemble complet des quatre lignées cellulaires knock-out Gα. Ces lignées cellulaires peuvent être utilisées pour étudier la signalisation Gα en aval des GPCR individuellement, ce qui augmentera notre compréhension de la signalisation GPCR45 et permettra finalement le développement de médicaments avec des effets thérapeutiques plus optimaux.

MetEnk (4042-v) et somatostatine (4023-v) ont été achetés auprès de Peptide Institute. S1P (62570) et CP-55490 (90084) ont été achetés auprès de Cayman Chemical. La dopamine (040-15433) a été achetée chez FUJIFILM Wako Pure Chemical. LPA (867130) et LysoPS (858143) ont été achetés chez Avanti Polar Lipid. CCL2 (Z03292) et CCL4 (Z02831) ont été achetés chez Genscript. Les plasmides utilisés dans le test Glosensor cAMP3 et le test de rejet de TGFα25 ont été décrits précédemment.

Les cellules HEK293A (Thermo Fisher Scientific) et leurs cellules ΔGαi dérivées ont été maintenues dans du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM, Nissui Pharmaceutical) additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (Gibco, Thermo Fisher Scientific), de pénicilline à 0,006 % (p/v) et de streptomycine à 0,01 % (p/v) (DMEM complet), et maintenues à 37 °C dans un incubateur humidifié équilibré avec 5% de CO2. Les transfections ont été réalisées en utilisant une solution de polyéthylèneimine (PEI) (Polyéthylèneimine "Max", Polysciences). En règle générale, les cellules HEK293 ont été ensemencées dans une plaque de culture à 6 puits à une densité cellulaire de 2 × 105 cellules par ml dans 2 ml de DMEM complet et cultivées pendant une journée dans un incubateur à CO2. Une solution de transfection a été mélangée en combinant une solution de plasmide diluée dans 100 µl d'Opti-MEM (Life technologies) et 4 µl de solution de PEI à 1 mg par ml dans 100 µl d'Opti-MEM. Les cellules transfectées ont encore été incubées pendant un jour avant d'être soumises à un dosage comme décrit ci-dessous.

Les cellules ΔGαi ont été obtenues par la stratégie itérative de mutagenèse induite par CRISPR / Cas9 illustrée sur la figure 1B. Les constructions d'ARNsg ciblant les gènes GNAI1, GNAI2, GNAI3, GNAO, GNAZ, GNAT1 et GNAT2 ont été conçues à l'aide du site Web CRISPR.MIT.EDU (déjà fermé) de sorte qu'un site de clivage d'ADN médié par SpCas9 (3 pb en amont de la séquence du motif adjacent protospacer (PAM)) englobe un site de reconnaissance d'enzymes de restriction. L'oligonucléotide sens et antisens codant pour l'ARN guide a été synthétisé (FASMAC) et inséré dans le site BbsI du vecteur pSpCas9 (BB) -2A-GFP (PX458) (un cadeau de Feng Zhang, Broad Institute, Cambridge, MA; Plasmide Addgene n° 48138). L'insertion correcte des séquences d'ARN guide a été vérifiée par séquençage selon la méthode Sanger (FASMAC). Les cellules HEK293A ont été ensemencées dans des plaques à 6 puits (1,0 × 105 cellules par ml dans 2 ml de DMEM complet) et 24 heures plus tard, transfectées avec une combinaison de vecteurs PX458 ciblant les gènes codant pour la sous-unité Gαi à l'aide de Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific). Trois jours plus tard, les cellules ont été récoltées et les 10 à 20 % des cellules positives à la GFP ont été isolées par un trieur de cellules activé par fluorescence (SH800 ; SONY). Les cellules isolées ont été distribuées dans des plaques à 96 puits pour expansion clonale. Les clones ont été analysés pour les mutations dans les gènes cibles par PCR et digestion par des enzymes de restriction en utilisant un système d'électrophorèse capillaire (MultiNA, Shimadzu). Les produits de PCR résistants aux enzymes de restriction ont été évalués pour leurs altérations de l'ADN génomique par séquençage direct ou clonage TA. Le ciblage réussi a été confirmé en évaluant l'inhibition de l'AMPc médiée par GPCR, comme décrit ci-dessous. Les séquences oligonucléotidiques codant pour les ARN guides, les amorces de PCR utilisées pour amplifier les sites de ciblage d'ARNsg et les enzymes de restriction utilisées pour digérer les produits de PCR ont été répertoriées dans le tableau supplémentaire 2.

L'ARN total des cellules HEK293 a été préparé à l'aide d'un kit GenElute Mammalian Total RNA Miniprep (Sigma-Aldrich). L'ARN total a été transcrit à l'aide de kits RT ADNc haute capacité (Applied Biosystems) conformément aux instructions du fabricant. Des PCR quantitatives en temps réel ont été réalisées avec TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (Takara Bio) et contrôlées par ABI Prism 7300 (Applied Biosystems). Les données d'expression d'ARN ont été normalisées à l'expression de GAPDH. Les séquences d'amorces PCR ont été répertoriées dans le tableau supplémentaire 3.

La transfection plasmidique a été réalisée dans une plaque à 6 puits avec un mélange de 1 µg (par puits dans une plaque à 6 puits) de plasmide pCAGGS codant pour le biocapteur Glo-22F cAMP (gène synthétisé avec optimisation des codons par Genscript), 200 ng de plasmide codant pour GPCR et 100 ng de plasmide codant pour la sous-unité Gαi. Après 1 jour d'incubation, les cellules transfectées ont été récoltées avec du D-PBS contenant 0, 53 mM d'EDTA, centrifugées à 190 g pendant 5 min et mises en suspension dans de l'albumine de sérum bovin à 0, 01% (BSA, qualité sans acide gras et sans protéase, Serva) et HEPES 5 mM (pH 7, 4) contenant une solution saline équilibrée de Hank (HBSS). Les cellules ont été ensemencées dans une plaque blanche à 96 puits (30 µl par puits) et chargées avec une solution de D-luciférine potassique (10 µl de solution 8 mM par puits ; FujiFilm Wako Pure Chemical). Après 2 heures d'incubation dans l'obscurité à température ambiante, la plaque a été lue pour son comptage luminescent initial (Spectramax L, Molecular Devices). Les cellules ont été traitées avec un ligand seul (dosage Gs) ou 10 µM de forskoline (FujiFilm Wako Pure Chemical) avec un ligand (dosage Gi) (10 µl de solution 5x par puits). Pour la mesure de la cinétique, les plaques ont été mesurées pendant 20 min et exprimées en valeurs de changement de pli. Les signaux luminescents de changement de pli de 16 min à 20 min après l'ajout du composé ont été moyennés et normalisés par rapport à ceux de l'état traité à la forskoline. À l'aide du logiciel Prism 9 (GraphPad Prism), les signaux d'AMPc ont été ajustés à une courbe concentration-réponse sigmoïdale à quatre paramètres, à partir de laquelle les valeurs EC50 et Emax ont été obtenues. Le regroupement hiérarchique du profil de couplage a été effectué en python à l'aide de la méthode Ward.

Le test de perte de TGFα a été effectué comme décrit précédemment avec des modifications mineures25. La transfection du plasmide a été réalisée dans une plaque à 6 puits avec un mélange de 500 ng (par puits dans une plaque à 6 puits) de plasmide codant pour AP-TGFa et de 200 ng de plasmide codant pour GPCR. Après 1 jour de culture, les cellules transfectées ont été récoltées par trypsinisation, culottées par centrifugation à 190 g pendant 5 min et lavées une fois avec 5 mM HEPES (pH 7,4) contenant du HBSS. Après centrifugation, les cellules ont été remises en suspension dans 6 ml de HBSS contenant de l'HEPES. La suspension cellulaire a été ensemencée dans une plaque de culture 96 puits (cell plate) à un volume de 90 µl (par puits ci-après) et incubée pendant 30 min dans un incubateur à CO2. Les cellules ont été traitées avec un ligand GPCR (10x, dilué dans du HBSS contenant 5 mM HEPES (pH 7,4) et 0,01 % (p/v) BSA. Après rotation des plaques cellulaires, 80 µl de milieu conditionné ont été transférés dans une plaque à 96 puits vide (plaque de milieu conditionné (CM)). Au total, 80 µl de solution de réaction AP (10 mM p-nitrophénylphosphate (p-NPP), 120 mM Tris- HCl (pH 9,5), NaCl 40 mM et MgCl2 10 mM) a été distribué dans les plaques cellulaires et les plaques CM. L'absorbance à 405 nm des plaques a été mesurée, à l'aide d'un lecteur de microplaques (SpectraMax 340 PC384, Molecular Devices), avant et après 1 heure d'incubation à température ambiante. La libération d'AP-TGFα induite par le ligand a été calculée en soustrayant le signal de signal de libération d'AP-TGFα induit par le ligand.

L'analyse par cytométrie en flux a été effectuée comme décrit précédemment3. La transfection plasmidique a été réalisée dans une plaque à 6 puits avec 1 µg (par puits dans une plaque à 6 puits) de Glo-22F, 100 ng de Gαi1 et une quantité variable de plasmide codant pour MOR hébergeant la séquence signal N-terminale de l'hémagglutinine, suivie de l'étiquette d'épitope FLAG et d'un lieur flexible de 15 acides aminés. Les cellules transfectées ont été récoltées en ajoutant 300 ul de D-PBS contenant 0,53 mM d'EDTA, suivi de 300 ul de HBSS contenant 5 mM d'HEPES (pH 7,4). La suspension cellulaire a été distribuée dans une plaque à fond en V à 96 puits (200 µl par puits, deux puits par échantillon). Après centrifugation à 700 g pendant 1 min, les cellules ont été lavées une fois avec du D-PBS et culottées. Les culots cellulaires ont été mis en suspension dans du D-PBS contenant 2 % de sérum de chèvre et 2 mM d'EDTA (tampon de blocage ; 100 µl par puits) et incubés pendant 30 minutes sur de la glace. Après centrifugation à 700 g pendant 1 min, les cellules ont été colorées avec un anticorps monoclonal anti-étiquette d'épitope FLAG (Clone 1E6, FujiFilm Wako Pure Chemicals ; 10 µg/mL dans le tampon de blocage ; 50 µl par puits) pendant 30 min sur de la glace. Après rinçage au D-PBS, les cellules ont été marquées avec un anticorps secondaire IgG anti-souris de chèvre conjugué à Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific ; dilution 10 µg/mL dans le tampon de blocage ; 25 µl par puits) pendant 15 min sur glace. Les cellules ont été lavées une fois avec du D-PBS, remises en suspension dans 100 ul de D-PBS contenant de l'EDTA 2 mM et filtrées à travers un filtre de 40 um. Les cellules marquées par fluorescence (environ 20 000 cellules par échantillon) ont été analysées par le cytomètre en flux EC800 (Sony). Le signal fluorescent dérivé d'Alexa Fluor 488 a été enregistré dans un canal FL1 et les données de cytométrie en flux ont été analysées par un logiciel FlowJo (FlowJo). Nous avons utilisé tous les signaux fluorescents enregistrés et calculé les intensités moyennes de fluorescence (MFI).

La transfection du plasmide a été réalisée dans une plaque à 6 puits avec un mélange de 500 ng de plasmide codant pour NES-LgBiT-miniGi1, dont la longueur de liaison entre LgBiT et miniGi1 a été étendue à 15 acides aminés à partir de la construction d'origine, et une quantité variable de plasmide MOR fusionné en C-terminal avec SmBiT (avec la séquence signal d'hémagglutinine N-terminale, suivie de l'étiquette d'épitope FLAG et d'une étiquette d'épitope 15- lieur flexible d'acides aminés). Après 1 jour de culture, les cellules transfectées ont été récoltées avec 1 ml de D-PBS contenant 0, 53 mM d'EDTA, suivi de l'ajout de 2 ml de HBSS contenant de l'HEPES. Les cellules ont été centrifugées à 190 g pendant 5 minutes et remises en suspension dans 2 ml de HBSS contenant 0, 01% de BSA et 5 mM d'HEPES (pH 7, 4) (tampon d'essai). La suspension cellulaire a été ensemencée dans une plaque blanche de culture à 96 puits (Greiner Bio-One) à un volume de 80 µl (par puits ci-après) et chargée avec 20 µl de solution de coelenterazine 50 µM (Carbosynth) diluée dans le tampon de dosage. Après incubation de 2 heures avec de la coelenterazine à température ambiante, MetEnk (6 uM, dilué dans le tampon d'essai) a été ajouté manuellement aux cellules (20 ul). Les signaux luminescents ont été mesurés toutes les 40 secondes après l'ajout de ligand et les valeurs moyennes de luminescence de 10 à 15 min ont été tracées.

Pour le test GloSensor cAMP et le test de perte de TGFα, trois expériences indépendantes ont été réalisées en double et en triple, respectivement. Pour l'analyse RT-PCR quantitative, trois expériences indépendantes ont été réalisées en double. Les symboles et les barres d'erreur représentent les valeurs moyennes et SEM des nombres indiqués d'expériences indépendantes, respectivement. Les courbes concentration-réponse ont été ajustées à toutes les données par la régression non linéaire : pente variable (quatre paramètres) dans le prisme 9 avec une contrainte de pente de colline de valeur absolue inférieure à deux. Pour l'analyse de comparaison multiple, nous avons testé la signification statistique par ANOVA à deux voies, suivie du test post hoc indiqué à l'aide de Prism 9.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Toutes les données générées ou analysées dans l'étude sont fournies dans les données supplémentaires 1.

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Nous remercions Ritsuki Kuramoto de l'Université de Tohoku pour son aide dans l'analyse de clustering ; Ayaki Saito et d'autres membres du laboratoire Inoue pour l'édition du manuscrit ; Kazuhiro Kobayashi et Osamu Nureki à l'Université de Tokyo pour la construction miniGi1. L'IA a été financée par les subventions KAKENHI 21H04791, 21H05113, JPJSBP120213501 et JPJSBP120218801 de la Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) ; Programme FOREST JPMJFR215T et Programme de recherche et développement JST Moonshot JPMJMS2023 de l'Agence japonaise pour la science et la technologie (JST) ; BINDS JP22ama121038 de l'Agence japonaise pour la recherche et le développement médicaux (AMED) ; Fondation scientifique Takeda ; Fondation commémorative d'Uehara. YO a reçu JSPS KAKENHI 20J20669.

Biochimie moléculaire et cellulaire, École supérieure des sciences pharmaceutiques, Université du Tohoku, Sendai, Miyagi, 980-8578, Japon

Yuki Ono, Kouki Kawakami, Gaku Nakamura, Satoru Ishida et Asuka Inoue

Département de chimie de la santé, École supérieure des sciences pharmaceutiques, Université de Tokyo, Bunkyo-ku, Tokyo, 113-0033, Japon

Junken Aoki

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Conceptualisation : YO et IA ; Enquête : YO, GN, KK et SI ; Rédaction : YO, KK et AI avec les commentaires de tous les coauteurs. Acquisition de financement : YO, JA et AI ; Encadrement : JA et AI

Correspondance avec Asuka Inoue.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie Bryan Roth, Ajith Karunarathne et l'autre examinateur, anonyme, pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Rédacteur principal de la manipulation : Joao Valente.

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Réimpressions et autorisations

Ono, Y., Kawakami, K., Nakamura, G. et al. La génération de cellules HEK293 knock-out Gαi illumine la diversité de couplage Gαi des GPCR. Commun Biol 6, 112 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04465-2

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Reçu : 03 août 2022

Accepté : 11 janvier 2023

Publié: 28 janvier 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-023-04465-2

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