Réduction assimilatrice des sulfates dans le méthanogène marin Methanothermococcus thermolithotrophicus

Nature Microbiology (2023)Citer cet article

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Methanothermococcus thermolithotrophicus est le seul méthanogène connu qui se développe sur le sulfate comme seule source de soufre, unissant de manière unique la méthanogénèse et la réduction des sulfates. Ici, nous utilisons des analyses physiologiques, biochimiques et structurelles pour fournir un instantané de la voie complète de réduction des sulfates de cet archéon méthanogène. Nous constatons que les étapes ultérieures de cette voie sont catalysées par des enzymes atypiques. Le PAPS (3′-phosphoadénosine 5′-phosphosulfate) libéré par l'APS kinase est converti en sulfite et en 3′-phosphoadénosine 5′-phosphate (PAP) par une PAPS réductase similaire aux APS réductases de la réduction dissimilatoire du sulfate. Une PAP phosphatase non canonique hydrolyse ensuite la PAP. Enfin, la sulfite réductase dépendante du F420 convertit le sulfite en sulfure pour l'assimilation cellulaire. Alors que les études métagénomiques et métatranscriptomiques suggèrent que la voie de réduction des sulfates est présente dans plusieurs méthanogènes, la voie d'assimilation des sulfates chez M. thermolithotrophicus est distincte. Nous proposons que cette voie a été «mix-and-matched» grâce à l'acquisition d'enzymes assimilatrices et dissimilatrices d'autres micro-organismes, puis réutilisée pour remplir un rôle métabolique unique.

Les micro-organismes producteurs de méthane les plus courants ont une forte demande en soufre en raison de leurs enzymes et de leur métabolisme spécifiques. Alors que la plupart de ces méthanogènes utilisent des sulfures (HS-), il a été démontré que certains métabolisent des états d'oxydation plus élevés du soufre ou même des sulfures métalliques (par exemple, FeS2) pour l'acquisition de soufre1,2,3,4,5. Cependant, Methanothermococcus thermolithotrophicus est le seul méthanogène connu capable de se développer sur le sulfate (\({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)) comme seule source de soufre4,6. Le métabolisme de cet hydrogénotrophe marin, isolé de sédiments marins chauffés par géothermie près de Naples (Italie), est paradoxal, car la réduction de \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) devrait conduire à plusieurs obstacles physiologiques pour un microbe producteur de méthane. Premièrement, les méthanogènes se développent généralement dans des environnements sulfurés réduits où tous les accepteurs d'électrons autres que le CO2 sont épuisés, y compris \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) (réfs. 7,8). Deuxièmement, à l'interface où les méthanogènes et les ions \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) coexistent, les méthanogènes hydrogénotrophes doivent entrer en compétition avec les micro-organismes réducteurs dissimilateurs \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) pour le substrat commun dihydrogène (H2)9. Troisièmement, les méthanogènes vivent aux limites thermodynamiques de la vie et l'hydrolyse de l'adénosine triphosphate (ATP) couplée à la réduction de \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) constituerait un investissement substantiel pour ces micro-organismes à énergie limitée8,10. Enfin, la voie de réduction \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) génère des intermédiaires toxiques qui interféreraient avec les processus cellulaires.

Pour assimiler \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\), l'organisme devrait capturer l'anion et le transporter dans la cellule à l'aide d'un transporteur. À l'intérieur de la cellule, \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) est activé par une ATP sulfurylase (ATPS) pour générer de l'adénosine 5′-phosphosulfate (APS)11,12,13. À partir de là, les organismes peuvent utiliser différentes stratégies (données étendues Fig. 1, voies a à c) : (1a) l'APS est directement réduit par une APS réductase (APSR) pour générer de l'AMP et \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\). (1b) Alternativement, l'APS peut être davantage phosphorylé en 3′-phosphoadénosine 5′-phosphosulfate (PAPS) par l'APS kinase (APSK). Une PAPS réductase (PAPSR) réduira le PAPS en \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) et le nucléotide toxique 3'-phosphoadénosine 5′-phosphate (PAP). Le PAP doit être rapidement hydrolysé en AMP et en phosphate inorganique par une PAP phosphatase (PAPP). Dans les deux scénarios, l'étape finale est réalisée par une sulfite réductase contenant du sirohème, qui réduit le \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) en HS−. Ce dernier peut ensuite être incorporé à la biomasse. (1c) Dans une voie différente, le groupe sulfite de PAPS est transféré à un autre accepteur pour accumuler des métabolites sulfatés. La voie 1a est très similaire à la voie dissimilatoire (Extended Data Fig. 1, voie 2). Cependant, les APSR dissimilatoires et les sulfite réductases dissimilatoires sont structurellement et phylogénétiquement distincts de leurs homologues assimilateurs et couplent indirectement leurs réactions aux pompes à membrane, permettant la conservation de l'énergie14,15,16.

Des gènes codant pour des enzymes putatives associées à la réduction de \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) ont été trouvés dans les génomes de plusieurs méthanogènes13, dont M. thermolithotrophicus. Pour ce méthanogène, une voie d'assimilation théorique, bien qu'incomplète, \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) peut être émise. Ici, nous avons élucidé la machinerie de réduction \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) complète de cet archéon et décrit comment ce méthanogène unique peut convertir \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) en un bloc élémentaire de vie.

Les cultures cultivées sur Na2S ont été successivement transférées dans un milieu sans soufre jusqu'à ce qu'aucune croissance ne soit observée. M. thermolithotrophicus a montré une croissance robuste lorsqu'au moins 100 µM de Na2SO4 ont été ajoutés dans le milieu et ont atteint des rendements cellulaires similaires à ceux de la culture Na2S. Dans ces conditions de culture, \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) est consommé au fil du temps à mesure que la densité cellulaire augmente (Fig. 1a). Lorsque les cellules sont cultivées uniquement sur Na2S, aucun \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) ne peut être détecté (Fig. 1a), indiquant que M. thermolithotrophicus n'effectue pas d'oxydation des sulfures.

a, cultures de M. thermolithotrophicus cultivées sur Na2S (carrés noirs, 0,5 mM) et Na2SO4 (carrés gris, 0,5 mM). La consommation ou la libération de \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) dans les cultures de Na2S ou de Na2SO4 sont indiquées respectivement par des triangles noirs et gris. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type et les valeurs individuelles sont présentées sous forme de sphères (n = 3 répétitions). Les différences entre la concentration attendue (0,5 mM) et mesurée (0,13 mM) \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) pour le point initial sont considérées comme étant dues à un artefact du milieu (voir Méthodes). b, M. thermolithotrophicus cultivé sur Na2SO4 10 mM dans trois fermenteurs indépendants. Les points d'échantillonnage sont représentés par des carrés gris. c, Molybdate (Na2MoO4) inhibition des archées assimilatrices et dissimilatrices de Na2SO4. Des expériences de croissance pour M. thermolithotrophicus ont été réalisées en double et pour A. fulgidus en quadruple (à gauche) ou en triple (à droite). Les données sont représentées sous forme de moyenne et pour les triples et quadruples ± sd d, opéron prédit pour \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) réduction à partir de la séquence de fusil de chasse du génome entier de M. thermolithotrophicus.

Données source

Nous avons ensuite contesté la culture \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) cultivée en passant du lot aux conditions de fermentation, où le H2S peut s'échapper vers la phase gazeuse et ne s'accumule pas par rapport aux conditions du flacon. Dans ce système ouvert à température et pH contrôlés, M. thermolithotrophicus a atteint une densité optique maximale (DO) 600 nm de 6,45 en 19 h (Fig. 1b).

Une façon de déterminer si M. thermolithotrophicus s'appuie sur les enzymes canoniques de la voie de réduction \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) consiste à utiliser le molybdate (\({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\)). L'analogue structurel de \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) se lie à l'ATPS et déclenche la molybdolyse, qui hydrolyse l'ATP en AMP et en pyrophosphate (PPi), entraînant un épuisement de l'énergie cellulaire17,18. Un rapport molaire \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\):\({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) de 0,004:1 est suffisant pour inhiber l'activité des bactéries dissimilatrices \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)-réductrices pendant 168 h, effet principalement dû à la molybdolyse par l'ATPS19,20, 21. \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) l'assimilation est également affectée par \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\), comme l'ont démontré des études sur les plantes22. Dans ce dernier cas, l'inhibition de la croissance s'est produite lorsque \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\) était en excès par rapport à \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) et l'activité ATPS était particulièrement affectée à un ratio de 1:118. Lorsqu'il est appliqué sur M. thermolithotrophicus, un rapport \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\):Na2S élevé de 12,5:1 n'a pas perturbé la croissance de la culture de Na2S, indiquant que \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\) n'interfère pas avec leur métabolisme de base. En revanche, un rapport \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\):\({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) de 6,25:1 était inhibiteur pour la culture \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) cultivée, alors qu'un rapport 1:1 ne l'était pas (Fig. 1c et Extended Data Fig. 2a). \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) l'addition à la culture inhibée par \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\) a restauré la croissance (Extended Data Fig. 2b), indiquant la réversibilité de l'inhibition et son contrôle strict par le \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\) :\({{\rm{SO}}}_{4}^{2- }\) plutôt que la concentration \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\). En comparaison, chez Archaeoglobus fulgidus, un archéon qui effectue une réduction \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) dissimilatoire pour conserver l'énergie, nous avons observé une inhibition de la croissance à un rapport \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\):\({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) de 0,001:1 (Fig. 1c et Données étendues Fig. 2c). Ces résultats suggèrent que M. thermolithotrophicus réduit \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) via une voie d'assimilation contenant un ATPS fonctionnel. Les gènes codant pour l'ATPS et l'APSK autonomes putatifs se trouvaient en effet sur le même locus dans le génome de la souche DSM2095 que nous avions reséquencé (Fig. 1d) (réfs. 13, 23). Pour confirmer leurs fonctions, l'ATPS et l'APSK de M. thermolithotrophicus (MtATPS et MtAPSK, respectivement) ont été caractérisés plus en détail.

L'activité des MtATPS et MtAPSK exprimées de manière recombinante a été testée via un test couplé (Fig. 2a et Fig. 1 supplémentaire) et une activité spécifique de 0, 070 ± 0, 004 µmol de NADH oxydé min-1 mg-1 de MtATPS a été mesurée. Dans ces conditions, l'étape limitant la vitesse était l'activité pyrophosphatase. Cela met en évidence la nécessité d'une dégradation rapide du pyrophosphate (Fig. 2a) pour éviter une rétro-inhibition comme indiqué précédemment pour d'autres ATPS24. Un rapport \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\):\({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) de 1:1,25 a diminué l'activité de moitié (voir Méthodes), corroborant le fait que l'ATPS réagit également avec \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\) comme le montrent d'autres homologues18,21.

a, panneau supérieur, réactions catalysées par MtATPS et MtAPSK ; Panneau inférieur, l'activité spécifique de MtATPS et MtAPSK, déterminée via un dosage enzymatique couplé. '-' indique l'absence du réactif indiqué. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type et les valeurs individuelles sont présentées sous forme de sphères grises (n = 3 répétitions). b, structure homodimère MtATPS dans laquelle un monomère est représenté en surface jaune clair et l'autre en dessin animé. c, Site actif de MtATPS (jaune) superposé à l'ATPS de Thermus thermophilus HB8 (PDB : 1V47, gris) contenant l'APS représenté sous forme de boules et de bâtons avec des carbones colorés en cyan. Les résidus impliqués dans la liaison au substrat sont mis en évidence dans les sticks et seuls ceux du MtATPS sont marqués. Les liaisons hydrogène entre l'ATPS de T. thermophilus et l'APS sont représentées en pointillés. L'azote, l'oxygène, le phosphore et le soufre sont respectivement colorés en bleu, rouge, orange et jaune. d, conservation de la séquence parmi les homologues ATPS. e, structure homodimère MtAPSK dans laquelle un monomère est représenté en surface orange clair et l'autre en dessin animé. La boucle souple illustrée par la ligne pointillée n'a pas pu être modélisée. Dans toutes les structures, les extrémités N et C sont représentées respectivement par une sphère bleue et rouge. f, conservation de la séquence parmi les homologues APSK. Pour d et f, les résidus gras rouges sont impliqués dans la liaison au substrat, tandis que les étoiles rouges et noires sont des résidus parfaitement et bien conservés, respectivement.

Données source

La structure de MtATPS a été affinée à une résolution de 1, 97 Å et obtenue dans un état apo malgré la co-cristallisation avec APS et \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) (Extended Data Table 1). Alors que le garnissage cristallin suggère un assemblage homotétramère sous deux formes cristallines, la chromatographie d'exclusion stérique et l'analyse de surface à l'aide de PISA (www.ebi.ac.uk/pdbe/pisa/) ont confirmé un état homodimérique similaire aux homologues bactériens (Extended Data Fig. 3a et Supplementary Fig. 2). La structure présente le pli ATPS typique comprenant trois domaines (domaine I, 1–156 ; domaine II, 164–314 et domaine III, 320–382 ; Fig. 2b). L'interface dimère est principalement organisée par le domaine III, comme observé chez T. thermophilus, une différence notable par rapport aux autres homologues structuraux (Extended Data Fig. 3a, b) (réfs. 25,26,27). Semblable à de nombreuses bactéries et archées thermophiles, le domaine III contient un domaine de liaison au zinc (320–343; Données étendues Fig. 3c, d) qui pourrait contribuer à la stabilité thermique27. La superposition de MtATPS avec des homologues structuraux montre un léger réarrangement de domaine probablement dû à l'absence de substrat (Extended Data Fig. 3b). Tous les résidus critiques pour la réaction sont conservés dans MtATPS, plaidant pour un mécanisme de réaction conservé (Fig. 2c, d, Données étendues Figs. 3e, f et 4a, et Fig. 3 supplémentaire).

Le modèle APS-kinase de M. thermolithotrophicus, MtAPSK, a été affiné à 1,77 Å. MtAPSK forme un homodimère avec une organisation très similaire aux enzymes bactériennes, ce qui était attendu en raison de sa conservation de séquence élevée (Extended Data Figs. 4b et 5a). Malgré la co-cristallisation et le trempage des cristaux avec de l'APS et du MgCl2, la structure MtAPSK a été obtenue dans son état apo avec un phosphate lié à la position attendue de l'ATP β-phosphate (Fig. 2e et Extended Data Fig. 5b, c). L'extrémité N-terminale et la région 125-152 (cette dernière étant impliquée dans la liaison au substrat) n'ont pas pu être modélisées en raison du manque de densité électronique. Cependant, les résidus liant les substrats et Mg2 + sont conservés (Fig. 2f, Données étendues Fig. 5b, c et Supplémentaire Fig. 4), suggérant que MtAPSK devrait être fonctionnel, comme le confirme le dosage enzymatique couplé.

Si l'ATPS et l'APSK sont actifs, ils produiront du PAPS, un intermédiaire qui pourrait suivre les voies métaboliques 1b ou 1c (Extended Data Fig. 1). Les deux voies conduiront à la production du produit toxique PAP, qui inhibe les sulfotransférases et les exoribonucléases, et perturbe le catabolisme de l'ARN30,31. Par conséquent, il doit être efficacement hydrolysé par une PAP phosphatase. Alors que le génome ne contenait aucune phosphatase PAP apparentée, un gène codant pour une phosphoestérase putative (Fig. 1d) a été trouvé dans l'environnement génomique abritant les gènes ATPS et APSK. Ce candidat PAP-phosphatase, appartenant à la famille DHH, a été exprimé par recombinaison et a produit du phosphate inorganique (Pi) à partir de PAP à des vitesses rapides (50,2 ± 5,9 µmol de Pi libéré min-1 mg-1 d'enzyme purifiée avec du manganèse). L'activité a été stimulée par l'addition de manganèse et a montré une grande spécificité vis-à-vis du PAP (Fig. 3a).

a, panneau supérieur, réaction catalysée par MtPAPP ; Panneau du bas, activité spécifique du MtPAPP déterminée via la production de Pi (à gauche) et activité enzymatique relative vis-à-vis de différents nucléotides (à droite). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type et les valeurs individuelles sont présentées sous forme de sphères grises (n = 3 répétitions). b, Organisation de MtPAPP montrée dans la représentation de bande dessinée. Les extrémités N et C sont mises en évidence sous forme de boules bleues et rouges, respectivement. Le carbone, l'azote, l'oxygène et le phosphore de l'AMP sont respectivement colorés en cyan, bleu, rouge et orange. c, Vue rapprochée du site actif de MtPAPP. Les résidus coordonnant l'AMP et l'ion Mn2+ sont mis en évidence par des sticks et colorés comme en b, avec les résidus du motif DHH colorés en rose. d, vue en coupe de la structure de MtPAPP montrée en représentation de surface et colorée par sa conservation de séquence sur 168 homologues archéens. Le dégradé de couleurs va de variable (sarcelle) à conservé (magenta). e, La représentation de la structure secondaire a été réalisée avec ESPript 3.0 (réf. 61). Le cadre coloré correspond aux différents domaines : domaine DHH en vert clair, linker en gris et domaine DHHA1 en vert plus foncé. Les résidus parfaitement et bien conservés de 168 homologues d'archées sont mis en évidence en rouge et en jaune, respectivement. Les structures secondaires composant MtPAPP sont étiquetées, dans lesquelles les feuillets β, les hélices α et les virages β sont mis en évidence sous forme de flèches, de ressorts et de TT en gras, respectivement.

Données source

Pour déchiffrer le mécanisme de cette phosphatase PAP non canonique (nommée MtPAPP), l'enzyme a été co-cristallisée avec du manganèse et du PAP. La structure, résolue par remplacement moléculaire avec une matrice générée par AlphaFold2 (réfs. 32,33), a été affinée à une résolution de 3,1 Å et contenait le produit AMP et un ion dans son site actif, modélisé comme un Mn2+ partiellement occupé (Extended Data Table 1). Bien que la séquence MtPAPP ne s'aligne pas sur les homologues appartenant à la famille DHH (à l'exception du motif DHH), elle partage un pli global similaire à l'exonucléase RecJ ou à l'oligoribonucléase NrnA de Bacillus subtilis (BsNrnA, qui présente également une activité PAP-phosphatase ; Données étendues Fig. 6a) (réf. 34, 35, 36). Le monomère est composé d'un domaine N-terminal (DHH, résidus 1 à 180) et d'un domaine C-terminal (DHHA1, résidus 211 à 315) interconnectés par une région de liaison (résidus 181 à 210), formant un sillon central (Fig. 3b). Le domaine DHH contient le site catalytique et le domaine DHHA1 sert d'échafaudage pour lier le substrat avec une spécificité élevée (Fig. 3b, c et Extended Data Fig. 6b). Le motif coordonnant l'ion Mn2+ dans RecJ et BsNrnA est parfaitement conservé dans MtPAPP34,36, donc nous nous attendons à ce que dans son état actif, MtPAPP soit chargé avec deux Mn2+. Le premier, partiellement observé dans la structure, est coordonné par quatre aspartates (Asp8, Asp10, Asp57, Asp127) et une interaction à longue distance avec His6. Le second Mn2+ absent serait coordonné par les Asp10, Asp57, Asp127, le motif DHH (His76, His77) ainsi que par les molécules d'eau (Extended Data Fig. 6c). Alors que l'AMP partage une localisation similaire avec des homologues structuraux (β9β10β11), il est lié par une interaction différente avec la protéine (Extended Data Fig. 6b et Supplementary Fig. 5). Le site de liaison des nucléotides placerait idéalement le 3′-phosphate du PAP devant le manganèse lorsque l'enzyme est dans son état fermé (Extended Data Fig. 6c). Le mouvement inter-domaine, permis par le lieur, faciliterait un échange rapide du substrat/produit, augmentant le chiffre d'affaires de MtPAPP. La séquence complète de cette PAP phosphatase a été trouvée dans le génome de 168 archées dans lesquelles le site de liaison des nucléotides est conservé (Fig. 3d, e et Supplémentaire Fig. 6). Cela suggère une enzyme commune chez les archées pour détoxifier le PAP (Extended Data Fig. 7a).

Aucun gène codant pour une PAPS réductase canonique (voie 1b) ou une sulfo-transférase (voie 1c) n'a été trouvé dans le génome de M. thermolithotrophicus. Cependant, des gènes annotés comme APS réductase dissimilatoires (sous-unités α et β, APSR; Données étendues Fig. 7b et Fig. 7 supplémentaire) sont présents et coexistent avec les gènes décrits précédemment (Fig. 1d).

Pour confirmer expérimentalement l'activité et la spécificité du substrat de cette enzyme de type APS-réductase, les deux sous-unités ont été co-exprimées dans Escherichia coli, purifiées et testées pour les tests d'activité enzymatique (Fig. 4a). Contrairement aux APSR dissimilatoires qui catalysent la réduction réversible de l'APS en AMP et \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) (réfs. 37,38), nous n'avons pas pu mesurer la réaction inverse (c'est-à-dire, AMP et \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\), ou PAP et \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) comme substrats) pour l'enzyme M. thermolithotrophicus en utilisant K3Fe(CN)6 comme accepteur d'électrons. Au lieu de cela, nous avons utilisé un test enzymatique couplé pour reconstituer la voie in vitro (Extended Data Fig. 8). Le MtATPS, une pyrophosphatase et le MtAPSK ont été utilisés pour générer du PAPS et du MtPAPP a été ajouté pour éliminer le PAP, un rétro-inhibiteur potentiel de la réaction39. L'activité a été contrôlée via l'oxydation du viologène de méthyle réduit (MVred). Lorsque tous les composants étaient présents, une activité enzymatique spécifique de 0,114 ± 0,007 µmol de MV min-1 mg-1 oxydé de l'enzyme de type APS-réductase a été mesurée. Un excès de cinq fois l'enzyme de type APS-réductase a entraîné une augmentation de 220% de l'activité enzymatique spécifique, indiquant que l'enzyme était l'étape limitant la vitesse de la réaction (données étendues Fig. 8c). Cependant, l'accumulation de PAP (induite par l'élimination de MtPAPP ou de Mn2+) a fortement inhibé l'activité. L'activité enzymatique spécifique avec l'APS en tant que substrat (c'est-à-dire l'élimination de MtAPSK) était de 0, 007 ± 0, 001 µmol de MV oxydé min -1 mg -1 de l'enzyme de type APS-réductase (Fig. 4a). Compte tenu de la complexité de ce dosage enzymatique couplé, les paramètres cinétiques n'ont pas pu être déterminés. Cependant, le test a fourni des informations sur la spécificité du substrat et a confirmé que l'enzyme de type APS-réductase de M. thermolithotrophicus présente des traits d'une réductase PAPS.

a, panneau supérieur, réaction catalysée par MtPAPSR ; Panneau inférieur, activité enzymatique relative de MtPAPSR, déterminée via un dosage enzymatique couplé (Extended Data Fig. 8). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type et les valeurs individuelles sont présentées sous forme de sphères grises (n = 3 répétitions). b, organisation MtPAPSR avec un hétérodimère en représentation de surface et l'autre en dessin animé. Les extrémités N et C des deux sous-unités sont représentées par des boules et colorées en bleu et rouge, respectivement. Les partenaires hétérodimériques sont étiquetés avec un nombre premier. Le carbone, l'azote, l'oxygène, le phosphore, le fer et le soufre sont respectivement colorés en citron, bleu, rouge, orange, marron et jaune. c, Gros plan sur les cofacteurs et le flux d'électrons. Les clusters [4Fe-4S] et les cystéines les coordonnant, le FAD et le Trp42 proposés pour participer au transfert d'électrons sont représentés en bâtonnets et en boules et colorés comme en b. d,e, Sites actifs d'APSR (d) de A. fulgidus contenant APS (AfAPSR, PDB : 2FJA) et MtPAPSR avec un PAPS modélisé artificiellement (e) montré avec une surface transparente. Les résidus impliqués dans la reconnaissance du substrat (basé sur le PAPS modélisé) sont en boules et en bâtonnets et colorés comme en b. Une flèche rouge pointe vers l'endroit où les PAPS s'affronteraient. f, Conservation de la séquence dans la sous-unité alpha de MtPAPSR, AfAPSR, Megalodesulfovibrio gigas (DgAPSR, PDB : 3GYX) et l'APSR putatif de Caldanaerobius fijiensis (CfAPSR, WP_073344903), qui partage 68 % d'identité de séquence avec MtPAPSR. Les résidus impliqués dans la liaison de l'APS pour l'APSR sont en gras et en rouge ; les résidus parfaitement et bien conservés sont mis en évidence respectivement par des étoiles rouges et noires. Trp206 et Tyr207 sont impliqués dans la liaison FAD. L'alignement de séquence a été fait avec MUSCLE62.

Données source

Pour obtenir des informations moléculaires supplémentaires sur l'enzyme non conventionnelle de type APS-réductase de M. thermolithotrophicus, l'enzyme a été cristallisée dans des conditions anaérobies. La structure a été résolue par une expérience de dispersion anormale à une seule longueur d'onde mesurée au bord Fe K et affinée à une résolution de 1, 45 Å (tableau de données étendu 1). Le complexe s'organise en hétérotétramère α2β2, avec le même assemblage que les APS réductases dissimilatoires (Fig. 4b et Extended Data Fig. 9). Il est cependant radicalement différent des réductases APS/PAPS assimilatrices à domaine unique caractérisées, qui sont dépendantes de la thiorédoxine/glutathion. Les réductases APS / PAPS assimilatrices ne partagent aucune homologie de séquence ou de structure avec l'enzyme de M. thermolithotrophicus, et plusieurs motifs proposés pour médier la liaison au substrat et l'activité catalytique dans les réductases APS / PAPS assimilatrices sont absents (Données étendues Fig. 9) (réf. 40).

Chez M. thermolithotrophicus, la sous-unité α, contenant la flavine adénine dinucléotide (FAD), fait partie de la famille des fumarate réductases37,41,42 et la sous-unité β est principalement composée d'un domaine de type ferrédoxine dans lequel deux clusters [4Fe-4S] sont coordonnés par huit résidus cystéine (Fig. 4c). Bien qu'il n'y ait pas d'homologues assimilateurs de P / APS-réductase à l'enzyme de M. thermolithotrophicus, il partage 38% d'identité de séquence avec la sous-unité α de la dissimilatrice APS réductase de A. fulgidus (AfAPSR PDB: 2FJA, rmsd de 1, 02 Å pour 437 Cα alignés sur la sous-unité α). Les résidus coordonnant l'APS, invariables dans la famille dissimilatoire, diffèrent chez M. thermolithotrophicus et pourraient provoquer un basculement de spécificité de l'APS vers le PAPS. Malgré un court trempage avec du PAP, la poche de substrat putative ne contient que du solvant, et nous avons utilisé l'AfAPSR pour modéliser artificiellement le PAPS dans le site actif de l'enzyme (Fig. 4d, e). Les différentes substitutions principalement portées par la boucle 104–123 accueilleraient le groupe 3′-phosphate supplémentaire par des interactions sel-pont et des liaisons hydrogène (Fig. 4d – f). Dans les APS réductases, cependant, une glutamine conservée (α145 dans A. fulgidus) entrerait en conflit avec ce groupe phosphate. Les résidus catalytiques proposés dans les APS réductases dissimilatrices sont conservés dans l'enzyme de M. thermolithotrophicus (Extended Data Fig. 9 et Supplementary Fig. 7). Nous proposons donc un mécanisme réactionnel identique sur la base d'une attaque nucléophile de l'atome N5 de FAD sur le soufre PAPS, qui crée un intermédiaire FAD-PAPS qui se désintègre en PAP et FAD-\({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) (réfs. 37,42). En prenant ensemble les taux d'enzymes et l'analyse structurelle, nous proposons que M. thermolithotrophicus héberge une classe unique de PAPS réductase (MtPAPSR) utilisée pour convertir le PAPS en \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) et PAP.

Le \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) généré par MtPAPSR doit encore être réduit à HS−. Chez les méthanogènes hydrogénotrophes, \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) endommage la machinerie génératrice de méthane et doit être détoxifié par la sulfite réductase dépendante du F420 (Fsr)23,43. Nous avons précédemment identifié et caractérisé le groupe I Fsr chez M. thermolithotrophicus (MtFsr) et déterminé une activité enzymatique robuste envers \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) (réf. 23). Outre une deuxième isoforme Fsr, M. thermolithotrophicus ne contient pas d'autres sulfite réductases potentielles. Alors que la spectrométrie de masse a confirmé que le Fsr isolé à partir de cellules cultivées \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) est le MtFsr caractérisé du groupe I, le rôle physiologique de la deuxième isoforme Fsr reste inconnu23. Par conséquent, MtFsr est le meilleur candidat pour catalyser la réduction finale de \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) en HS−. L'électrophorèse sur gel de polyacrylamide natif (PAGE native) avec des extraits cellulaires de cultures cultivées sur différents substrats soufrés a confirmé l'absence de MtFsr dans les cellules cultivées sur Na2S et sa forte abondance dans les cellules cultivées sur \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) (réfs. 23,43).

Nous avons déterminé une activité spécifique de sulfite réductase de 18,42 ± 0,13 µmol de MV min−1 mg−1 oxydé d'extrait cellulaire de cellules cultivées au Na2SO3, par rapport à 7,31 ± 0,63 µmol de MV min−1 mg−1 oxydé d'extrait cellulaire de cellules cultivées au Na2SO4, alors que l'extrait cellulaire d'une culture cultivée au Na2S avait une activité spécifique de sulfite réductase de 3,04 ± 0,25 µmol de MV min−1 mg−1 oxydé (Fig. 5a). En accord, nous avons observé une bande compatible avec Fsr sur la PAGE native pour la culture cultivée \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) mais en quantités inférieures par rapport aux conditions \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) (Fig. 5b). La structure MtFsr récemment publiée par notre groupe a été obtenue à partir de cellules \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) cultivées, ce qui a confirmé qu'il s'agit de la même enzyme exprimée que dans les conditions \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\)23. Pris ensemble, ces résultats indiquent que MtFsr est utilisé comme dernière enzyme dans la voie de réduction \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) (Fig. 5c).

a, Activité sulfite-réductase dans un extrait cellulaire de M. thermolithotrophicus cultivé sur différentes sources de soufre. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type et les valeurs individuelles sont présentées sous forme de sphères grises (n = 3 répétitions biologiquement indépendantes). b, gel hrCN avec extrait cellulaire de M. thermolithotrophicus cultivé sur différentes sources de soufre (15 µg de protéines chargées par échantillon, n = 2 doublons biologiquement indépendants). c, Voie d'assimilation proposée \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) chez M. thermolithotrophicus. Les arrière-plans jaunes et gris mettent en évidence les voies de réduction et de méthanogenèse \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\), respectivement. Les flèches épaisses indiquent des flux métaboliques élevés. Les structures des enzymes opérant la voie d'assimilation \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)-assimilation sont représentées en surface, avec des ligands sous forme de boules et de bâtons. Les enzymes sont abrégées comme suit : Fwd/Fmd, formylméthanofurane déshydrogénases ; Ftr, tétrahydrométhanoptérine (H4MPT) formyltransférase; Mch, méthényl-H4MPT cyclohydrolase; Mtd, méthylène-H4MPT déshydrogénase; Mer, 5,10-méthylène-H4MPT réductase; Mtr, N5-CH3-H4MPT : coenzyme M méthyl-transférase ; Mcr, méthyl-coenzyme M réductase; Adk, adénylate kinase; Frh, [NiFe]-hydrogénase réductrice de F420; Eha/Ehb, hydrogénase à conversion d'énergie. Les transporteurs putatifs \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) appartenant à la classe DASS/SUIP sont proposés comme étant WP_018154444/WP_018154062 et la pyrophosphatase WP_018154121.

Données source

Les méthanogènes utilisent couramment HS− comme source de soufre, et ceux qui expriment le Fsr de type I peuvent également se développer sur \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) (réfs. 13,23,43). Fait intéressant, certains méthanogènes ont des gènes qui codent pour les protéines de la voie de réduction complète ou partielle \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) (Fig. 8 supplémentaire) (réf. 13). Alors pourquoi M. thermolithotrophicus est-il le seul méthanogène à ce jour dont il a été prouvé qu'il pousse sur \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) ? Nous avons utilisé Methanocaldococcus infernus comme organisme modèle pour approfondir cette question. M. infernus est un hyperthermophile marin qui partage une physiologie très similaire avec M. thermolithotrophicus et peut se développer dans le même milieu. Il contient tous les gènes codant pour les enzymes caractérisées dans cette étude à l'exception du PAPSR décrit. Cependant, le génome de M. infernus code pour un PAPSR et un APSR putatifs dépendants de la thiorédoxine, qui partagent des identités de séquence élevées avec l'APSR et le PAPSR assimilateurs biochimiquement caractérisés de M. jannaschii (Fig. 6a et Extended Data Fig. 7b) (réfs. 44,45). Par conséquent, sur la base des informations génomiques, M. infernus devrait être capable d'assimiler \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\).

a, Methanocaldococcus infernus a le potentiel génomique d'effectuer l'ensemble de la voie d'assimilation \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\). WP_013099421 a une identité de séquence d'acides aminés de 59,68 % avec le MtPAPP, WP_013099422 a une identité de séquence de 70,60 % avec MtATPS et WP_157198836 a une identité de séquence de 75,44 % avec MtAPSK. L'APSR (WP_013100115) et le PAPSR (WP_013099852) sont similaires à l'APSR et au PAPSR caractérisés biochimiquement de M. jannaschii (68,64 % et 58,35 % d'identité de séquence d'acides aminés, respectivement), dont il a été démontré qu'ils réduisent l'APS/PAPS44,45. WP_013099852 n'est pas homologue à MtPAPSR mais homologue à WP_018154242, une PAPS réductase putative chez M. thermolithotrophicus. WP_013100746 a une identité de séquence de 65,30 % avec le groupe I MtFsr. b, Croissance de M. thermolithotrophicus et M. infernus sur du Na2S 2 mM, sans source de soufre supplémentaire, du Na2SO3 2 mM, du Na2SO4 2 mM ou du Na2SO4 2 mM avec du Na2S 2 mM. Le \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) entre parenthèses indique qu'il a été utilisé comme substrat de soufre pour l'inoculum. Représentées sont les DO600nm maximales des cultures, en triple, indiquées comme moyenne ± sd Les cultures de M. infernus cultivées sans soufre, Na2SO4 et sur Na2S avec Na2SO4 sont en double. Le point de données individuel de chaque répétition est représenté par une sphère.

Données source

M. thermolithotrophicus et M. infernus ont été cultivés dans le même milieu et dans les mêmes conditions de culture, sauf que M. infernus a été maintenu à 75 ° C et M. thermolithotrophicus à 65 ° CM infernus a poussé sur 2 mM de Na2S et Na2SO3 mais n'a pas pu utiliser \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) comme seule source de soufre contrairement à M. thermolithotrophicus (Fig. 6 b).

Cela soulève la question de la fonction physiologique des gènes liés à l'assimilation \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) chez les archées méthanogènes. Sur la base de nos données, il se pourrait que d'autres méthanogènes aient encore besoin de ces enzymes pour acquérir du soufre via la voie 1c (Extended Data Fig. 1). Le groupe soufre serait transféré à un accepteur par une sulfo-transférase non canonique, ce qui pourrait être important pour les voies de biosynthèse inexplorées. Cela pourrait expliquer pourquoi le gène codant pour le PAPP est toujours présent chez les méthanogènes hébergeant également les gènes codant pour une ATPS ainsi qu'une APSK. Un contre-argument à cette hypothèse est la présence du PAPSR ou APSR dépendant de la thiorédoxine, caractérisé chez M. jannaschii, qui plaide plutôt pour la voie 1b (réf. 13, 44, 45). Il est à noter que le gène codant pour cet APSR assimilateur putatif existe également chez M. thermolithotrophicus (WP_018154242.1). Par conséquent, d'autres investigations biochimiques seront nécessaires pour élucider les rôles physiologiques de ces enzymes dans les méthanogènes.

Ce travail a dévoilé le métabolisme unique d'assimilation \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)-d'un archéon méthanogène, offrant un instantané moléculaire de l'ensemble complet d'enzymes impliquées dans la voie. M. thermolithotrophicus active \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) par l'ATPS et l'APSK conventionnels, mais le transforme davantage par des enzymes non canoniques (Fig. 5c).

Le PAPS produit par l'APSK est généralement métabolisé par des PAPS réductases assimilatrices dépendantes de la thiorédoxine ou du glutathion, qui sont organisées en homo-oligomères. En revanche, MtPAPSR a hérité de l'organisation hétérotétramérique et du mécanisme catalytique basé sur le FAD des réductases APS dissimilatoires (Fig. 4 et Données étendues Fig. 1 et 9). Nous proposons que la substitution de seulement quelques acides aminés a fait basculer la spécificité vers le PAPS (Fig. 4d – f), ce qui pourrait avoir été le résultat d'une adaptation évolutive affinée pour favoriser la réduction assimilatrice de \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\). Il serait intéressant d'échanger les résidus qui confèrent des traits PAPSR au site actif (Ser122, Lys120, Arg121) avec ceux d'APSR et d'observer les effets sur l'affinité au substrat.

Le PAP généré est efficacement hydrolysé par MtPAPP. Cette PAP phosphatase appartient à la famille DHH des phosphoestérases et partage une homologie de structure avec les exonucléases mais n'a aucune homologie de séquence avec elles. En comparaison, les PAP phosphatases conventionnelles (qui font partie de la superfamille FIG) ont un pli différent (c'est-à-dire CysQ) et utilisent trois ions magnésium pour hydrolyser le 3'-phosphate de PAP30. MtPAPP semble être un exemple remarquable d'évolution convergente, illustrant comment les archées ont développé leur propre appareil pour détoxifier efficacement les PAP.

Le groupe I Fsr catalyse la dernière étape de la voie de réduction \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\). Cette enzyme présente des traits distincts des sulfite réductases dissimilatrices, avec la composition du site actif d'une assimilatrice23. En codant le gène fsr sur un locus différent et très probablement sous un régulateur différent pour son expression (par exemple, un capteur de sulfite), le méthanogène est capable de découpler la désintoxication rapide \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) de l'expression de l'ensemble de la machinerie d'assimilation \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\). Alors que le MtATPS, le MtAPSK et le MtPAPSR montrent des taux catalytiques plutôt lents (voir Discussion supplémentaire), le MtFsr et le MtPAPP ont des activités spécifiques élevées par rapport aux premières étapes, déclenchant l'équilibre vers la production de HS− et éliminant efficacement les intermédiaires toxiques. Bien que notre voie proposée (Fig. 5c) permette une thermodynamique favorable, les premières réactions doivent être régulées pour éviter une hydrolyse inutile de l'ATP. Nous soupçonnons que MtATPS, MtAPSK et MtPAPSR sont régulés de manière croisée par l'accumulation de leurs propres produits, comme déjà montré pour les homologues39,46,47, ce qui permettrait un rétrocontrôle direct pour harmoniser le flux de soufre intracellulaire.

M. thermolithotrophicus vit à la limite thermodynamique de la vie, mais l'assimilation \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) décrite nécessite l'hydrolyse de trois ATP en ADP pour un \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) transformé. Néanmoins, on s'attend à ce que dans des conditions naturelles, le bénéfice de la fixation de \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) contrebalance la dépense énergétique. Les cultures cultivées en \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) ne sont pas gênées par le besoin énergétique supplémentaire, qui peut s'expliquer par nos conditions de culture qui fournissent une pression partielle en H2 élevée et constante. Dans des conditions environnementales, avec une pression partielle de H2 plus faible et fluctuante, la croissance sur \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) est susceptible d'être plus difficile pour M. thermolithotrophicus. Bien que le méthanogène ne puisse pas éviter l'investissement en ATP, il a peut-être trouvé une stratégie d'économie d'énergie pour la réaction de réduction à 8 électrons de PAPS en HS−. Fsr oxyde F420H2, qui est réduit par l'hydrogénase réductrice de F42023,48. F420H2 ou NAD(P)H seraient des donneurs d'électrons intéressants pour MtPAPSR, mais cela nécessiterait l'assistance d'un partenaire oxydase qui n'a pas encore été identifié. Alternativement, le MtPAPSR autonome peut dépendre de la ferrédoxine réduite, qui pourrait être obtenue à partir de la réduction de la ferrédoxine dépendante de H2 via le complexe Eha/Ehb, une autre stratégie avantageuse des hydrogénotrophes pour fournir un pouvoir réducteur pour alimenter les réactions anaboliques (proposé sur la Fig. 5c) (réf. 49).

Jusqu'à présent, il semble que le processus concomitant de méthanogénèse et de réduction complète de \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) en HS− soit limité à M. thermolithotrophicus. De manière frappante, la seule différence apparente entre M. thermolithotrophicus et d'autres méthanogènes ayant le potentiel génomique d'effectuer une réduction \ ({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) est l'acquisition d'une PAPS réductase, qui semble appartenir à la famille dissimilatoire (Fig. 8 supplémentaire, Données étendues Fig. 7b et Discussion supplémentaire). La fonction physiologique de ces gènes associés à la réduction de \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) chez d'autres méthanogènes reste à découvrir, ainsi que les avantages de l'assimilation de \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) pour M. thermolithotrophicus. D'un point de vue écologique, il pourrait être bénéfique, voire essentiel, pour la survie de M. thermolithotrophicus de pouvoir passer de l'absorption de H2S à une réduction de \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) dans des conditions environnementales (voir Discussion supplémentaire).

La transplantation du système de réduction de M. thermolithotrophicus \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) dans des hôtes méthanogènes, qui sont déjà utilisés comme convertisseurs de gaz (par exemple, Methanothermobacter), contournerait le besoin de H2S hautement toxique et explosif en utilisant \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\). Au-delà d'ouvrir des possibilités fantastiques pour des applications biotechnologiques plus sûres, un méthanogène hydrogénotrophe réducteur de \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) renforce également la question de l'étendue d'une voie entrelacée de méthanogénèse et de réduction des sulfates au cours de l'évolution des premières archées. M. thermolithotrophicus a très probablement assemblé l'ensemble de la voie de réduction \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) progressivement via un scénario "mix-and-match", offrant un avantage concurrentiel dans des conditions de source de soufre fluctuantes et élargissant ses niches écologiques.

Les cellules de M. thermolithotrophicus (DSM 2095), M. infernus (DSM 11812) et A. fulgidus (DSM 4304) ont été obtenues auprès du Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (Braunschweig, Allemagne). M. thermolithotrophicus et M. infernus ont été cultivés dans le même milieu minimal décrit précédemment avec quelques modifications23 (voir Extended Data pour la composition complète du milieu).

La croissance cellulaire a été suivie par spectrophotométrie en mesurant la DO600. La pureté de la culture a été vérifiée par microscopie optique. Les méthanogènes ont été cultivés avec 1 × 105 Pa de H2:CO2 à un rapport 80:20 en phase gazeuse. M. infernus a été cultivé à 75 °C dans des flacons de sérum en verre de 250 ml et M. thermolithotrophicus a été cultivé à 65 °C dans des flacons ou des fermenteurs. Les flacons de sérum n'étaient pas agités mais reposés. A. fulgidus a été cultivé dans des tubes Hungate anaérobies et scellés de 22 ml, avec 0,8 × 105 Pa N2:CO2. La culture DSM 4304 (0,5 ml) a été cultivée dans 10 ml de milieu classique (voir Matériel supplémentaire pour la composition complète de la composition du milieu) contenant une concentration finale de 20 mM de d/l-lactate. La culture a été incubée à 80°C, debout. Toutes les cultures ont été stockées à température ambiante dans l'obscurité dans des conditions anaérobies. Pour le milieu A. fulgidus, nous avons constaté que des concentrations élevées de molybdate le rendaient instable. L'une des bouteilles avec une concentration élevée en MoO42− est devenue jaune (sans rapport avec la contamination par l'O2) et a été omise, ce qui a entraîné des cultures en triple au lieu de quadruples (Fig. 1c, panneau de droite).

Les cellules de M. thermolithotrophicus cultivées sur Na2S 2 mM ont été successivement transférées dans 10 ml de milieu de culture sans soufre. Après deux transferts, la concentration en soufre résiduelle de l'inoculum n'a pas soutenu la croissance de M. thermolithotrophicus. En ajoutant 2 mM de Na2SO4, la croissance de M. thermolithotrophicus a repris. Aucun agent réducteur n'a été ajouté pour faire face à l'absence de HS-, qui établit normalement un environnement réducteur approprié. L'incubation sans agitation est particulièrement importante pour la reproductibilité. Par conséquent, après l'inoculation, les cultures ont été incubées à 65 °C, au repos pendant une nuit, puis agitées à 180 tours par minute (rpm) jusqu'à ce qu'elles atteignent leur DO600 maximale. La phase gazeuse a été rafraîchie après l'incubation d'une nuit pour maintenir la pression à 1 × 105 Pa de H2:CO2. Pour mesurer la concentration minimale de \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) requise pour soutenir la croissance, des cellules de M. thermolithotrophicus limitées en soufre (en utilisant un rapport inoculum/milieu de 1:20) ont reçu 2 mM, 1 mM, 0,5 mM, 0,25 mM, 0,1 mM et 0,04 mM de Na2SO4. La croissance était encore observable pour les cellules cultivées sur 0,1 mM mais pas sur 0,04 mM de Na2S04.

La chromatographie ionique (Methrom ion chromatograph) a été utilisée pour mesurer les concentrations de \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\), analysées via le logiciel IC MagIC Net 3.2. Un volume de 8 ml par échantillon était nécessaire, avec une concentration maximale de 0,5 mM \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\). Des cellules de M. thermolithotrophicus réductrices \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) ont donc été cultivées dans des bouteilles Duran de 1 l avec 100 ml de milieu sans soufre, qui a été complété par 0,5 mM \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) avant l'inoculation. En tant que contrôle négatif, des cellules de M. thermolithotrophicus cultivées dans du Na2S 0, 5 mM ont été utilisées, inoculées et collectées de la même manière que les cultures réductrices \ ({{\ rm {SO}}} _ {4} ^ {2-} \) . Tous les échantillons ont été prélevés en aérobiose et ont été passés à travers un filtre de 0,45 uM (Sartorius). Si les densités cellulaires étaient trop élevées pour être filtrées, les échantillons ont été centrifugés à 13 000 × g pendant 7 min à 4 ° C et le surnageant a été prélevé pour des mesures de chromatographie ionique. Les échantillons ont été conservés à 4 °C si les mesures n'ont pas été effectuées immédiatement.

M. thermolithotrophicus a été cultivé dans trois fermenteurs indépendants à 60 °C, avec 10 mM de Na2SO4 comme seule source de soufre. Pour chaque fermenteur, 7 l de milieu de culture anaérobie (voir Milieu de culture sans soufre pour Methanococcales) additionné de 10 mM de Na2SO4 ont barboté en continu avec H2:CO2 (80:20, 3 l min-1). Sous agitation (220 rpm), le milieu a été ensemencé avec 360 ml de préculture (avec une DO600 supérieure à 3). Une heure après l'inoculation, la culture a été agitée à 800 tr/min. Du NaOH (1 M) a été utilisé comme base pour réajuster le pH lors de l'acidification, qui a été contrôlée à l'aide d'une sonde de pH. Les cellules ont été cultivées jusqu'à la fin de la phase exponentielle (OD600 de 6,25 à 6,8) puis immédiatement transférées dans une tente anaérobie (atmosphère N2:CO2 dans un rapport de 90:10). Les cellules ont été recueillies par centrifugation anaérobie pendant 30 min à 6 000 × g à 4 °C. La DO600nm la plus élevée enregistrée pour M. thermolithotrophicus dans un fermenteur cultivé au SO42 était de 6,8 après 20 h. \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) La culture (7 l) avec une DO600 de 6,8 a donné 54 g de cellules (poids humide). Le culot cellulaire a été transféré dans une bouteille scellée, gazé avec 0, 3 × 105 Pa N2, congelé instantanément dans du N2 liquide et stocké à -80 ° C.

Les séquences d'ADN de l'ATP sulfurylase, de l'APS kinase, de la PAP phosphatase et des sous-unités α et β de la PAPS réductase de M. thermolithotrophicus ont été optimisées en codons pour E. coli, synthétisées et clonées dans des vecteurs pET-28a(+). Pour MtATPS, MtAPSK et MtPAPP, les sites de restriction Ndel et BamHI ont été utilisés, avec un codon stop (TGA) incorporé avant BamHI. Pour MtPAPSR, une étiquette His a été placée à l'extrémité C-terminale de la sous-unité α et un site de liaison au ribosome a été inséré entre les séquences codantes des sous-unités α et β. La construction MtPAPSR avait les sites de restriction NcoI et BamHI, avec un codon d'arrêt incorporé après l'étiquette His pour la sous-unité a et un codon d'arrêt avant BamHI pour la sous-unité ß. Ces étapes ont été réalisées par GenScript (GenScript). Toutes les séquences utilisées sont détaillées dans Informations supplémentaires sous Constructions et optimisation des codons géniques.

Toutes les constructions ont été surexprimées et purifiées dans des conditions aérobies selon un protocole similaire, à l'exception de MtPAPSR qui a été surexprimée et purifiée dans une atmosphère anaérobie. Toutes les enzymes ont été passées sur une colonne haute performance HisTrap (GE Healthcare), suivie, si nécessaire, d'un clivage par étiquette et d'une filtration sur gel (voir Matériel supplémentaire pour le protocole complet).

Les MtATPS, MtAPSK et MtPAPP purifiés ont été conservés dans 25 mM de Tris/HCl pH 7,6, 10 % v/v de glycérol, 2 mM de dithiothréitol et 150 mM de NaCl. MtPAPSR a été conservé dans le même tampon sans NaCl. Des échantillons non congelés fraîchement préparés ont été immédiatement utilisés pour la cristallisation. Des cristaux de MtATPS, MtAPSK et MtPAPP ont été obtenus dans des conditions aérobies à 18 °C. Les cristaux de MtPAPSR ont été obtenus en anaérobiose (N2:H2, rapport gazeux de 97:3) par criblage initial à 20 °C. La méthode de la goutte assise a été réalisée sur des plaques de cristallisation 96 puits MRC 2 gouttes en polystyrène (SWISSCI) contenant 90 µl de solution de cristallisation dans le réservoir.

MtATPS (0,7 µl) à une concentration de 14 mg ml-1 (MtATPS forme 1, tableau de données étendu 1) ou à une concentration de 27 mg ml-1 (MtATPS forme 2) a été mélangé avec 0,7 µl de solution réservoir. Le MtATPS à 27 mg ml-1 a été co-cristallisé avec 2 mM d'AMPcPP ainsi que 2 mM de Na2SO4. Pour la forme 1 de MtATPS, des cristaux transparents en forme d'étoile sont apparus après quelques semaines dans les conditions de cristallisation suivantes : 35 % p/v d'éthoxylate de pentaérythritol (15/4 EO/OH) et 100 mM d'acide 2-(N-morpholino)éthanesulfonique (MES) pH 6,5. Pour la forme 2 de MtATPS, des cristaux transparents, longs mais minces en forme de plaque sont apparus après quelques semaines dans les conditions de cristallisation suivantes : 20 % w/v polyéthylène glycol 8000, 100 mM MES pH 6,0 et 200 mM d'acétate de calcium.

MtAPSK (0,7 µl) à une concentration de 17,6 mg ml-1 a été mélangé avec 0,7 µl de solution réservoir et co-cristallisé avec 2 mM de MgCl2. Des cristaux transparents en forme de plaques sont apparus après quelques semaines dans les conditions de cristallisation suivantes : 20 % p/v de polyéthylèneglycol 3350 et 100 mM de citrate trisodique pH 5,5. MtAPSK a également été cristallisé avec 2 mM MgCl2 et 2 mM APS mais les structures obtenues de ces cristaux étaient de résolution inférieure et sans aucun substrat ou produit présent dans le site actif.

MtPAPSR (0,7 µl) à une concentration de 20 mg ml-1 a été mélangé avec 0,7 µl de solution réservoir et co-cristallisé avec FAD (concentration finale 0,5 mM). Le cristal utilisé pour le phasage était un carré plat marron et apparaissait après quelques jours dans les conditions de cristallisation suivantes : 40 % v/v 2-méthyl-2,4-pentanediol et 100 mM Tris/HCl pH 8,0.

Le cristal utilisé pour affiner à haute résolution était brun avec une forme de plaque allongée. Il apparaît après quelques jours dans les conditions de cristallisation suivantes : 35% v/v 2-méthyl-2,4-pentanediol, Tris 100 mM pH 7,0 et NaCl 200 mM. Avant le transfert dans du N2 liquide, le cristal a été trempé dans 10 mM de 3'-phosphoadénosine 5'-phosphate disodique pendant 7 min.

MtPAPP (0,7 µl) à une concentration de 20 mg ml-1 a été mélangé avec 0,7 µl de solution réservoir et co-cristallisé avec Tb-Xo4 (concentration finale 10 mM), MnCl2 (concentration finale 2 mM) et PAP 2 mM. Le Tb-Xo4 est un agent de nucléation/phasage50, qui devrait augmenter les performances de cristallisation ; cependant, dans ce cas, la même forme cristalline a été obtenue en l'absence du composé et diffractée à une résolution similaire. Des cristaux bipyramides transparents sont apparus après quelques semaines dans les conditions de cristallisation suivantes : citrate trisodique 1,6 M.

La manipulation des cristaux MtPAPSR a été effectuée à l'intérieur de la tente Coy sous atmosphère anaérobie (N2: H2, 97: 3); les autres cristaux ont été manipulés dans des conditions aérobies. Les cristaux ont été directement plongés dans de l'azote liquide ou ont été trempés pendant 5 à 30 s dans leur solution de cristallisation additionnée d'un cryoprotecteur avant d'être congelés dans de l'azote liquide. Pour la forme 2 de MtATPS, 30% de glycérol a été utilisé comme cryoprotecteur. Pour MtAPSK, 25% d'éthylène glycol a été utilisé comme cryoprotecteur.

Les cristaux ont été testés et collectés à 100 K à différents synchrotrons (tableau de données étendu 1). Les données ont été traitées avec autoPROC51 à l'exception de MtPAPP, qui a donné de meilleures statistiques avec l'indexation par le logiciel de détection de rayons X (XDS) et l'étape de mise à l'échelle effectuée avec SCALA52. Toutes les statistiques de collecte de données sont fournies dans le tableau de données étendu 1. Les formes 1 et 2 de MtATPS, MtAPSK et MtPAPP ont été résolues en utilisant PHENIX avec les modèles suivants : 1V47 (ATPS de T. thermophilus) pour la forme 1 de MtATPS, la forme 1 de MtATPS pour la forme 2 de MtATPS et 5CB6 (kinase APS de Synechocystis sp.) Pour MtAPSK. Pour MtPAPP, le modèle a été créé de novo à l'aide d'AlphaFold 2 (réf. 32).

Pour MtPAPSR, un spectre de fluorescence X sur le bord Fe K a été mesuré pour optimiser la collecte de données à la longueur d'onde appropriée. Les ensembles de données ont été collectés à 1,73646 Å pour l'expérience de dispersion anormale à une seule longueur d'onde. Les ensembles de données natifs ont été collectés à une longueur d'onde de 0,97625 Å sur un autre cristal. Les données ont été traitées et mises à l'échelle avec autoPROC51. Le phasage, la modification de densité et la construction automatique ont été réalisés avec CRANK-2 (réf. 53).

Tous les modèles ont été reconstruits manuellement avec COOT et affinés avec PHENIX54,55. Au cours de l'affinement, une symétrie non cristallographique et une vis à libration translationnelle ont été appliquées. Pour toutes les structures à l'exception de l'ATPS forme 1, les hydrogènes ont été ajoutés en position de conduite lors du dernier cycle de raffinement. Les hydrogènes ont été éliminés dans les modèles déposés finaux.

Tous les modèles ont été validés à l'aide de MolProbity56. La collecte de données et les statistiques de raffinement, ainsi que les codes d'identification PDB pour les modèles déposés et les facteurs de structure sont répertoriés dans le tableau de données étendu 1. Les chiffres ont été générés avec PyMOL (Schrödinger). Le métal dans MtATPS a été modélisé comme du zinc à l'aide de CheckMyMetal57.

Pour visualiser les niveaux d'expression de MtFsr lorsque les cellules ont été cultivées sur différentes sources de soufre, hrCN PAGE a été réalisée. Les cultures de M. thermolithotrophicus (2 × 10 ml) ont été complétées avec du Na2S 2 mM, du Na2SO3 2 mM, du Na2S 2 mM et du Na2SO4 2 mM, ou du Na2SO4 2 mM comme substrats de soufre et cultivées pendant une nuit à 65 ° C, debout. Les cellules ont été recueillies par centrifugation anaérobie à 6 000 × g pendant 20 min à température ambiante et les culots cellulaires ont été remis en suspension dans 2 ml de tampon de lyse (50 mM de tricine pH 8, 0 et 2 mM de dithionite de sodium). Les cellules ont été soniquées 4x à 70% d'intensité pendant 10 s, suivies d'une pause de 30 s (sonde MS 73, SONOPULS Bandelin). Le hrCN PAGE a été exécuté en anaérobiose et le protocole est détaillé dans Extended Data sous hrCN PAGE préparation. Un gel avec un gradient d'acrylamide de 8 à 15 % a été exécuté (illustré à la Fig. 5b) et un autre avec un gradient d'acrylamide de 5 à 15 % (voir Source Data Fig. 5).

L'activité des deux enzymes a été déterminée par la production d'ADP qui a été couplée à l'oxydation du NADH via la pyruvate kinase et la lactate déshydrogénase58. Les dosages ont été effectués dans un volume final de 100 µl de plaques à puits profonds à 96 puits et surveillés par spectrophotométrie (lecteur de microplaques multimode Omega) à 360 nm à 35 °C. Du KH2PO4 (100 mM) à pH 7,0, additionné de MgCl2 1,5 mM et de KCl 100 mM, a été utilisé comme tampon. Pour le NADH, un coefficient d'extinction molaire de 4 546,7 cm-1 M-1 a été déterminé expérimentalement pour les conditions susmentionnées. Au tampon, 1 mM NADH, 2,5 mM Na2SO4, 1 mM phosphoénolpyruvate (PEP), 2 mM ATP, 2 U inorganique pyrophosphatase (Saccharomyces cerevisiae, 10108987001, Sigma-Aldrich), 1,1 U ml-1 lactate déshydrogénase, 0,8 U ml-1 pyruvate kinase (muscle de lapin, P 0294, Sigma-Aldrich) et 0,5 mg ml-1 MtAPSK (toutes les concentrations finales) ont été ajoutés. La réaction a été démarrée par l'ajout de 0,5 mg ml-1 MtATPS. L'ajout de 0,02 mM de Na2MoO4 n'a pas affecté l'activité (0,116 ± 0,027 µmol de NADH oxydé min-1 mg-1), mais l'ajout de 2 mM de Na2MoO4 a entraîné une diminution (0,068 ± 0,019 µmol de NADH oxydé min-1 mg-1). Tous les tests ont été effectués en triple.

L'activité du MtPAPP a été déterminée par la production d'orthophosphate, qui a été quantifiée à l'aide du kit de dosage du phosphate vert de malachite (Sigma-Aldrich) par la formation d'un complexe vert. Les dosages ont été effectués dans des plaques à puits profonds de 96 puits et l'absorbance à 620 nm a été suivie par spectrophotométrie (lecteur de microplaques multimode Omega). Tris/HCl (25 mM) à pH 7,64 a été utilisé comme tampon. Du tampon, 40 µM de PAP ou 90 µM d'AMP/ADP/ATP/APS ou PPi, 1 mg ml-1 d'albumine de sérum bovin, 50 µM de MnCl2 et/ou 50 µM de MgCl2 (concentration finale) ont été mélangés dans un tube Eppendorf de 1,5 ml sur de la glace. Du MtPAPP préalablement congelé (concentration finale de 0,5 µg ml-1) a été ajouté et le mélange (volume final de 40 µl) a été immédiatement incubé pendant 5 min à 40 °C. Ensuite, 14 µl du mélange réactionnel ont été dilués dans 66 µl de Milli-Q H2O filtré et immédiatement congelés instantanément dans du N2 liquide pour désactiver la réaction. Ensuite, 20 µl de réactif vert malachite ont été ajoutés aux échantillons, le mélange a été incubé à température ambiante pendant 30 min et la formation du complexe vert a été mesurée à 620 nm. Tous les tests ont été effectués en triple. Les mesures présentées sur la figure 3a proviennent de deux expériences différentes (sous-panneaux gauche et droit). Les deux expériences ont été réalisées à deux jours différents avec la même préparation enzymatique.

Le PAPS étant instable à haute température, nous avons d'abord essayé de déterminer l'activité de MtPAPSR dans le sens de la production de PAPS, comme décrit précédemment pour les APS réductases dissimilatrices pour la production d'APS38. L'oxydation du PAPS a été déterminée dans un tampon Tris/HCl 50 mM (pH 7,5) contenant du Na2SO3 5 mM, du PAP 2 mM ou de l'AMP 2 mM (concentrations finales) et 3,27 µg ml-1 MtPAPSR. La réaction a été démarrée avec une concentration finale de 0,5 mM de K3Fe(CN)6. La diminution de l'absorbance à 420 nm a été mesurée et corrigée pour la réaction de fond sans enzyme. Aucune activité n'a été détectée. Par conséquent, nous avons utilisé la réaction physiologique pour surveiller l'activité de MtPAPSR. Pour effectuer le test MtPAPSR couplé, les enzymes devaient être purifiées en même temps et immédiatement utilisées pour le test (voir Matériel supplémentaire pour le protocole de purification détaillé des enzymes utilisées dans ce test).

Les tests d'activité MtPAPSR ont été effectués dans une atmosphère anaérobie (100% N2) à 45 ° C. Les dosages ont été effectués dans un volume final de 200 µl dans des plaques à puits profonds à 96 puits et contrôlés par spectrophotométrie sur un lecteur de microplaques SPECTROstar Nano. HEPES (50 mM, pH 7,0) additionné de KCl 50 mM, MnCl2 1,5 mM et MgCl2 1,5 mM a été utilisé comme tampon. Le viologène de méthyle réduit (MVred, 0,5 mM) a servi de donneur d'électrons pour MtPAPSR. Le coefficient d'extinction molaire (ε600nm = 8 133,3 cm-1 M-1) a été déterminé expérimentalement en utilisant les conditions susmentionnées et en réduisant le viologène de méthyle avec du dithionite de sodium 2 mM. Pour le dosage, le méthylviologène a été réduit avec du monoxyde de carbone par la CO-déshydrogénase de Clostridium autoethanogenum selon un protocole précédemment publié59. Le CO a été remplacé par du N2 et le MVred a été immédiatement utilisé pour le dosage. Au tampon et au MVred, 5 mM d'ATP, 1 mM de dithionite de sodium, 0,2 U de pyrophosphatase (E. coli, MFCD00131379, Sigma-Aldrich), 0,127 mg ml-1 MtATPS, 0,12 mg ml-1 MtAPSK, 0,1 mg ml-1 MtPAPP et 0,0645 mg ml-1 MtPAPSR ont été ajoutés. La réaction a été démarrée par l'ajout de 5 mM de Na2SO4 et suivie d'une oxydation de MVred à 600 nm. Tous les tests ont été effectués en triple.

Pour déterminer l'activité sulfite réductase de M. thermolithotrophicus, des cultures ont été cultivées sur du Na2S 2 mM, du Na2SO3 2 mM ou du Na2SO4 dans 10 ml du milieu mentionné ci-dessus dans des flacons de sérum. Les cellules (9 ml) ont été recueillies en phase exponentielle tardive (OD600 : 3,45 pour 2 mM Na2S, 3,91 pour 2 mM Na2SO3, 3,37 pour Na2SO4) par centrifugation à 6 000 × g pendant 10 min à 4 °C. Le surnageant a été jeté et les culots cellulaires ont été congelés dans du N2 liquide. Les culots ont ensuite été remis en suspension dans 1 ml de KH2PO4 0,5 M pH 7,0. Les cellules ont été lysées par sonication (2 × 10 s à 50% d'intensité, sonde MS73, SONOPULS Bandelin), suivie d'une centrifugation à 4 ° C à 15 600 × g. Le surnageant a été passé à travers un filtre de 0,2 µm et la concentration en protéines a été déterminée par la méthode de Bradford (6,63 mg ml-1 pour 2 mM Na2S, 6,14 mg ml-1 pour 2 mM Na2SO3 et 6,31 mg ml-1 pour Na2SO4). Les dosages d'activité ont été réalisés sous atmosphère anaérobie (100% N2) à 50°C dans des plaques deepwell 96 puits et contrôlés par spectrophotométrie (lecteur de microplaques SPECTROstar Nano). Le mélange d'essai contenait 0,5 M de KH2PO4 pH 7,0, 118 µM de MVred (concentration finale, préalablement réduite avec la quantité équimolaire de dithionite de sodium) et 30 µM de Na2SO3 (concentration finale). Dans ces conditions, un coefficient d'extinction molaire de ε600nm = 9 840 cm−1 M−1 a été déterminé expérimentalement. La réaction a été démarrée par l'ajout de 0,05 µg d'extrait cellulaire, suivi d'une oxydation de MVred à 600 nm. Tous les tests ont été effectués en triple.

Pour une description détaillée de l'analyse phylogénétique, voir Documents supplémentaires60.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Toutes les structures utilisées pour la comparaison structurelle sont accessibles à partir de la Protein Data Bank et sont donc citées dans le texte. Les structures ont été déposées dans la Protein Data Bank sous l'ID : 8A8G pour MtATPS forme 1, 8A8D pour MtATPS forme 2, 8A8H pour MtAPSK, 8A8K pour MtPAPP et 8A8O pour MtPAPSR. Les données de cette étude sont disponibles dans le document et ses informations supplémentaires. Les données sources sont fournies avec ce document.

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Nous remercions l'Institut Max Planck de microbiologie marine et la Société Max Planck pour leur soutien continu ; le synchrotron SOLEIL pour l'allocation du temps de faisceau et le personnel de la ligne de lumière de Proxima-1 pour l'assistance à la collecte des données ; le personnel de la ligne de lumière X06DA de SLS et P11 à PETRA III ; DR Dean pour nous avoir fourni le plasmide RE pDB1281 ; C. Probian et R. Appel pour leur soutien continu au laboratoire de métabolisme microbien et la culture d'Archaeoglobus fulgidus ; G. Wegener et M. Alisch du HGF MPG Joint Research Group for Deep-Sea Ecology and Technology pour leur aide dans les mesures de chromatographie ionique ; U. Ermler, J. Fritz-Steuber et G. Fritz pour leurs excellentes discussions et commentaires critiques concernant le manuscrit. Cette recherche a été financée par la Max-Planck Gesellschaft et la fondation Novo Nordisk (NNF21OC0070790, TW). MJ a été soutenu par le Deutsche Forschungsgemeinschaft Schwerpunktprogram 1927 "Fer-soufre pour la vie" (WA 4053/1-1, MJ).

Financement en libre accès fourni par Max Planck Society.

Microbial Metabolism Group, Institut Max Planck de microbiologie marine, Brême, Allemagne

Marion Jespersen et Tristan Wagner

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MJ a cultivé les méthanogènes, purifié et cristallisé toutes les protéines décrites dans cette étude. MJ a effectué toutes les caractérisations biochimiques. MJ et TW ont collecté des données radiographiques et résolu les structures. MJ et TW ont affiné et validé tous les modèles. TW et MJ ont conçu la recherche et rédigé l'article.

Correspondance à Tristan Wagner.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Microbiology remercie M. Elizabeth Stroupe et le(s) autre(s) relecteur(s) anonyme(s) pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Assimilatoire \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)-réduction. (Voie 1a, 1b, 1c) \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) est activé par l'ATP-sulfurylase (par exemple Glycine max, PDB : 4MAF) en APS. (1a) L'APS est directement réduit en sulfite (\({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\)) et en AMP par un cluster [4Fe-4S] contenant l'APS-réductase (par exemple Pseudomonas aeruginosa, PDB : 2GOY, dépendant de la thiorédoxine). (1b, c) Alternativement, l'APS est encore phosphorylé par une APS-kinase (par exemple Arabidopsis thaliana, PDB : 3UIE) pour produire du PAPS. (1b) Une PAPS-réductase (Saccharomyces cerevisiae, PDB : 2OQ2, dépendante de la thiorédoxine) convertit la PAPS en \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) et PAP. Le PAP sera hydrolysé en phosphate inorganique (Pi) et en AMP par une PAP-phosphatase (par exemple Mycobacterium tuberculosis, PDB : 5DJJ). (1a, b) Une sulfite-réductase (Escherichia coli, PDB : 1AOP) réduit le \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) en S2−, qui peut ensuite être incorporé dans la biomasse. Dans la voie 1c, une sulfotransférase (par exemple A. thaliana, PDB : 5MEK) catalyse le transfert du groupe sulfo (R-OSO3-) du PAPS vers un accepteur alcool ou amine. \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)-réduction dissimilatoire. \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) est activé par l'ATPS en APS et encore réduit à \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) par une APS-réductase (par exemple Archaeoglobus fulgidus, PDB : 2FJA), qui contient deux clusters [4Fe-4S] et un FAD. Une sulfite-réductase (par exemple A. fulgidus, PDB : 3MM5) réduit le \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) et le ramifie sur le porteur DsrC. Le complexe membranaire DsrMKJOP (par exemple Allochromatium vinosum) réduit le soufre en HS− en même temps que la translocation ionique pour la conservation de l'énergie. Sirohemes, FAD et [4Fe-4S]-clusters sont représentés dans des bâtons et des sphères, avec du carbone, de l'oxygène, de l'azote, du soufre et du fer colorés en rose, rouge, bleu, jaune et orange. Les enzymes sont représentées en bande dessinée et en surface transparente dans leur état oligomère. L'ATPS d'A. fulgidus a été modélisé à l'aide d'Alphafold232 et coloré en vert. L'ATP-sulfurylase bifonctionnelle CysDN utilisant un GTP supplémentaire, n'a pas été présentée ici pour simplifier le schéma.

a, \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\) tolérance de M. thermolithotrophicus. L'archéon a été cultivé sur \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) (carré gris), \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) complété par une quantité équimolaire de \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\) (carré de blé) et \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) complété par un excès de \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\) (carré rouge foncé). Comme contrôle, des cultures cultivées au Na2S (S2-, triangle noir) et des cultures cultivées au Na2S avec un excès de \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\) (triangle rouge) ont été utilisées. Cette expérience de croissance a été réalisée en double. b, Effet des ratios \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\):\({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) dans les cultures de M. thermolithotrophicus cultivées sur 0,5 mM de Na2SO4. Les carrés gris indiquent la courbe de croissance des réducteurs \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) sans addition de \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\). Les carrés rouges indiquent la courbe de croissance des réducteurs \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) exposés à 5 mM de \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\), suivi de l'ajout de 25 mM de Na2SO4. Les flèches noires en pointillés indiquent le temps d'ajout de \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\) et \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\). Cette expérience de croissance a été réalisée en triple. c, Archaeoglobus fulgidus sensibilité envers \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\). Ici, un rapport \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\):\({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) de 0,001:1 est suffisant pour inhiber la croissance d'A. fulgidus. Les données présentées sont des quadruples à l'exception du ratio \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\):\({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) le plus bas et le plus élevé, qui ont été réalisées en triple. Toutes les expériences sont représentées sous forme de données moyennes et pour b, c ± écart type (sd).

Données source

a, Comparaison de l'ATPS en représentation de surface, colorée par la composition du domaine I (jaune), II (vert clair), III (blé) et APS kinase (orange foncé). Les surfaces grises correspondent au monomère opposé. ScATPS s'organise en homohexamère. b, les monomères de MtATPS (jaune), TtATPS (gris), ScATPS (bleu marine), RrsATPS (magenta), GmATPS (vert) et AaATPS (cyan) sont superposés sur le domaine II et représentés sous forme de dessins animés. Les abréviations et rmsd se trouvent dans le tableau supplémentaire 1. c, d, surface impliquée dans l'oligomérisation de MtATPS (c) et TtATPS (d). Un monomère est affiché en représentation de surface et un monomère est affiché en dessin animé. Les contacts monomère-monomère, établis par le domaine III d'une chaîne (en orange pour MtATPS et noir pour TtATPS), sont représentés par une surface rouge. La surface couleur blé met en évidence le domaine III. L'entrée encadrée est un gros plan du motif de liaison Zn et les résidus coordonnant le Zn sont dessinés sous forme de bâtons. Le carbone, l'azote et le soufre sont respectivement colorés en orange/blanc, bleu et jaune. e, f, site catalytique de MtATPS (apo, e) et TtATPS avec APS lié (f). Les éléments sont colorés comme dans les entrées (c, d) avec de l'oxygène et du phosphore en rouge et orange, respectivement. Les résidus appartenant aux motifs canoniques de l'ATPS sont mis en évidence par des atomes de carbone de couleur rose.

a, L'adénylyltransférase sulfate hétérodimérique (CysDN) avec l'homo-oligomère sulfurylase dépendante de l'ATP (sat) et b, les APS-kinases. Pour le panneau a : l'ATP-sulfurylase assimilatrice hétérodimérique est composée d'une sous-unité régulatrice de la GTPase CysN (rouge clair) et d'une sous-unité catalytique CysD (bleue). Sat est impliqué à la fois dans la réduction assimilatrice et dissimilatoire \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) (orange clair). MtATPS et MtAPSK sont surlignés en rouge gras. Les valeurs de prise en charge du bootstrap ≥ 90 % sont affichées sous forme de points sur les nœuds intérieurs.

a, Panneau de gauche, apo MtAPSK homodimérique (orange) superposée à son homologue le plus proche Synechocystis sp. PCC 6803 (SsAPSK, blanc, PDB : 5CB6) en complexe avec APS et AMP-PnP. Les ligands sont représentés dans des bâtons et des sphères et la partie manquante 125–152 dans MtAPSK (indiquée par des boules) est surlignée en noir dans SsAPSK. Le carbone, l'azote, l'oxygène, le soufre et le phosphore sont colorés respectivement en orange clair/blanc/cyan, bleu, rouge, jaune et orange. Panneau de droite : superposition de MtAPSK (blé), AtAPSK (orange, PDB : 3UIE), ApAPSK (ardoise, PDB : 2YVU) et PcAPSK (blanc, PDB : 1M7H) sur un monomère et illustré en dessin animé. La position du site actif est indiquée par une flèche noire. Les abréviations et rmsd se trouvent dans le tableau supplémentaire 2. b, c, site catalytique de l'apo MtAPSK (b) et SsAPSK liés à l'APS et à l'AMP-PnP (c). Les éléments sont colorés comme dans (a), panneau de gauche. En (b), les flèches indiquent la partie manquante 125–152.

a, Conservation du repliement à travers le MtPAPP, la NanoRNase A de Bacillus subtilis (BsNrnA, PDB : 5IUF) et la recombinase RecJ de Deinococcus radiodurans (DrRecJ, PDB : 5F55). Pour BsNrnA et DrRecJ, les structures ne représentent que les domaines DHH et DHHA1 et les motifs de structure secondaire sont renumérotés pour simplifier la comparaison avec MtPAPP. b, Différences de liaison nucléotidique entre MtPAPP, NanoRNase A et la recombinase RecJ avec les résidus de surface interagissant avec le ligand coloré en vert. c, Gros plan sur la coordination Mn2+ entre MtPAPP, BsNrnA (APB : 5IZO) et DrRecJ (APB : 5F55). Les Mn2+ sont représentés sous forme de sphères violettes et les résidus qui les coordonnent sont mis en évidence sous forme de bâtons et de boules. Les atomes de carbone, d'azote, d'oxygène et de phosphore sont colorés respectivement en vert/gris, bleu, rouge et orange. Les résidus appartenant au motif canonique DHH ont des atomes de carbone de couleur rose. La structure utilisée pour BsNrnA est la variante His103Ala, et la chaîne latérale de His160 n'a pas été modélisée dans la structure DrRecJ.

a, PAP-phosphatases avec des oligoribonucléases bifonctionnelles et des PAP-phosphatases, ainsi que des exonucléases (RecJ), et b, des APS-réductases dissimilatrices (sous-unité α) et des APS/PAPS-réductases assimilatrices (putatives). MtPAPSR et MtPAPP sont surlignés en rouge gras. Les valeurs de prise en charge du bootstrap ≥ 90 % sont affichées sous forme de points sur les nœuds intérieurs. Les astérisques (*) devant les séquences de Methanocaldococcus jannaschii mettent en évidence les deux enzymes préalablement caractérisées biochimiquement.

a, schéma du dosage enzymatique couplé utilisé pour mesurer l'activité de MtPAPSR via l'oxydation du viologène de méthyle réduit (MVred) à 600 nm sous une atmosphère de N2 et à 45 ° C. Les enzymes ont été exprimées par recombinaison dans E. coli, à l'exception de la pyrophosphatase, qui a été obtenue dans le commerce. Le mélange réactionnel contenait toutes les enzymes, les métaux (Mn2+, Mg2+), le tampon HEPES à pH 7,0 et les substrats \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) et ATP. La réaction a été démarrée par l'ajout de \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\). b, c, 'Vide' correspond à une solution contenant le tampon, les substrats, MVred et dithionite mais pas d'enzymes. "Tous les composants" contenaient chaque composé indiqué dans le schéma (a). b, spécificité de substrat de MtPAPSR. 'No MtAPSK' correspond à tous les composants sauf MtAPSK, qui a empêché la génération de PAPS à partir d'APS. Avec l'APS comme substrat, une activité enzymatique spécifique de 0,007 ± 0,001 µmol de MV.min-1.mg-1 oxydé de PAPSR a été mesurée, soit seulement 6,54 % de l'activité avec l'APSK (correspond à la Fig. 4a, +APS -ATPS -APSK). La différence peut être attribuée à une instabilité de l'APS ajouté. c, Impact de différentes concentrations de MtPAPSR sur l'activité : Une addition quintuple de MtPAPSR a entraîné une stimulation du taux d'oxydation du MV de 220 % (indiqué par des carrés vert foncé, "5 × plus de MtPAPSR"). Après 30 minutes, l'addition quintuple de la MtPAPS-réductase a conduit à l'agrégation, c'est pourquoi la DO600nm a commencé à augmenter après ce moment. Toutes les expériences ont été réalisées en triple et représentées par la moyenne des données ± sd

Données source

Toutes les structures sont représentées en dessin animé avec leurs (métallo)-cofacteurs en boules et en bâtons. Les gros plans des sites actifs (à droite) avec des résidus importants pour la liaison au substrat sont mis en évidence sous forme de boules et de bâtons. L'APS-réductase dissimilatrice d'Archaeoglobus fulgidus est un hétérotétramère, composé de deux sous-unités (αβ). Chaque sous-unité β contient deux clusters [4Fe-4S] et chaque sous-unité α un FAD. L'APSR assimilateur présenté de Pseudomonas aeruginosa est un homotétramère. Il contient un cluster [4Fe-4S] par monomère. Le PAPSR assimilateur de Saccharomyces cerevisiae est homodimérique. Les éléments oxygène, azote, phosphore, soufre et fer sont respectivement colorés en rouge, bleu, orange, jaune et marron. Le carbone du substrat/produit est coloré en cyan, et en jaune pour le FAD. Les résidus catalytiques sont mis en évidence par des étiquettes rouges.

Fig. supplémentaires. 1 à 8, tableaux 1 et 2, constructions et optimisation des codons géniques, et discussion.

Dossier de matériel complémentaire.

Données sources statistiques pour la Fig. 2 supplémentaire.

Données sources statistiques.

Gels natifs non transformés.

Données sources statistiques.

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Réimpressions et autorisations

Jespersen, M., Wagner, T. Réduction assimilatrice de sulfate dans le méthanogène marin Methanothermococcus thermolithotrophicus. Nat Microbiol (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01398-8

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Reçu : 28 février 2023

Accepté : 26 avril 2023

Publié: 05 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41564-023-01398-8

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